荧光显微技术在黎族药物大青鉴定中的应用

http://www.microimage.com.cn田建平(2011-06-10 14:47:46)

作者:田建平,胡远艳,张俊清

【摘要】目的:探讨利用荧光显微技术对黎族药物大青进行显微鉴别的可行性,并为建立大青药物质量标准提供依据。方法:利用研究级正置荧光显微镜对未经试剂处理的大青茎粉末和新鲜叶片进行观察,并拍照。结果:大青茎粉末中主要含有3种类型的纤维,还含有木栓细胞、网状导管、方晶、腺毛和非腺毛、钟乳体,且图像清晰。更特别的是在表皮细胞中还含有铜钱状的物质及一圈荧光存在于皮层中。在叶片下表皮中气孔数较多,角质层细胞波纹状、还有钟乳体、2细胞的腺毛、非腺毛等结构。结论:利用荧光显微镜鉴别生药粉末,操作简便,图像直观,值得开发利用。在叶片鉴别方面角质层、腺毛等结构清晰可辩,可代替扫描显微镜,但是还需结合普通光学显微镜来确定气孔的类型。

【关键词】荧光显微镜;大青;黎族药物;显微鉴定

[ABSTRACT] Objective: To explore the feasibility of fluorescence microscopic technique in the identification of Clerodendrum cyrtophyllum used in Li medicine and to collect scientific evidence for the development of its quality standards. Methods: The stem powder without reagent and fresh leaves of Clerodendrum cyrtophyllum were observed and photographed under fluorescent microscopy. Results:Under fluorescent microscopy, it was clearly shown that stem powder of Clerodendrum cyrtophyllum was mainly consisted of 3 types of fiber, cork cells, mesh tube, square crystal, glandular, non glandular and cystolith. More specifically, there were coinlike substances in the epidermis, a fluorescent ring in the cortex. Many stomata in the lower epidermis with ripplelike cuticle cells, cystolith, 2 cells glandular hairs, nonglandular hairs were shown in the fresh leaves images. Conclusions:It is feasible to use fluorescence microscopic technique in the identification of stem powder of Clerodendrum cyrtophyllum and the cuticle cells and glandular hairs in fresh leaves, but light microscope is also needed for the identification of stomata types.

[KEY WORDS] Fluorescence microscopy; Clerodendrum cyrtophyllum; Li medicine; Microscopic identification

黎族药物大青来源于马鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz., 其根、茎、叶入药,夏秋季采收,洗净,鲜用。长期以来在华南地区常代替板蓝根使用[1-3]。其黎药名为雅枫能,茎叶入药,具有清热解毒的功效[4]。前人已对其根、茎的横切片显微结构进行了研究,但是对茎粉末结构的研究未见报道,在叶结构方面,也未见有研究报道[5]。另外,以往研究均利用普通光学显微镜,均需用试剂处理,才能观察,并需一定的绘图机能。在荧光技术方面,以往的荧光分析技术需将有效成分用试剂提取后才能在荧光分光光度计下测量其荧光光谱[6,7],操作较麻烦。在叶片研究方面有报道认为利用荧光显微镜可观察气孔形状,但不知对叶片其他结构形态是否有效[8],因此,在本研究中通过尝试对未经试剂处理的生药粉末和新鲜叶片在荧光显微镜下,进行观察,以探讨利用荧光显微技术进行生药显微鉴定的可行性,为开拓一种简便有效的显微鉴定方法,同时为黎族药物大青质量标准的建立及开发黎药提供科学依据。

1 材料与方法

马鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz., 从海南医学院黎族药用植物观赏园采集,将其茎去掉叶片后晒干粉碎,取其粉末作为试验材料。另外在实验前夕取成熟大青叶片一块,冲洗干净晾干备用。所用仪器为研究级正置荧光显微镜(Olympus BX51)。

1.2 方法

在研究级正置荧光显微镜(Olympus BX51)的

光下找到大青茎粉末观察目标,再关上光栅,在荧光下观察,并拍照。从备用大青叶片中间剪取2mm×2mm的叶块,背面朝上置于载玻片盖上盖玻片后,同样先在自然光下找到观察目标,再关上光栅,在荧光下观察,并拍照。

2 结果

粉末淡黄色,含有的纤维主要有3种,即X形,L形和分叉状等纤维(图1A~C),木栓细胞表面观四边形,排列较整齐(图1D),晶鞘纤维含量丰富,里面同样含有很多数量的方晶(图1E)。导管多破碎,多为网纹导管(图1F~G),在粉末中含有钟乳体、石细胞(图1H~I),在木部薄壁细胞可看到一圈绿色的荧光,很快消失。在粉末中含有一定数量的非腺毛和腺毛(图1J~K),值得注意的是在表皮细胞中还有许多铜钱状的分泌组织(图1L)。

大青叶下表皮浅绿色,在荧光显微镜下其角质层细胞垂周壁波状或深波状弯曲(图1M),在叶表皮中可以看到存在钟乳体(图1N),单位面积上气孔数量较多,同时也存在较多2细胞的腺毛,及少量非腺毛(图1O)。

3 讨论

3.1 大青茎粉末结构与大青茎横切片结构比较

报道[3], 大青茎(径约5mm)之横切面,最外缘表皮细胞,散见非腺毛;皮层韧皮纤维与石细胞,多个连生,排列成环,强木化,形成层,2~3层,细胞小,呈类长方形或扁长方形。木质部,由导管、木部薄壁细胞、髓线所组成,导管单个或2~4个连生,主要为网纹导管;髓线细胞呈类长方形、类方形及扁长方形;木部薄壁细胞,与导管伴生,细胞呈类长方形、类方形及扁长方形。中央为髓部,散见石细胞及草酸钙方晶。

本组研究中,大青粉末除含有上述非腺毛、石细胞、方晶、导管、纤维外还具有少数腺毛和钟乳体,而钟乳体是马鞭草科植物的一个显著特征。另外纤维的种类也较丰富,因此粉末研究是生药显微研究中不可缺少的内容。由于大青在华南地区分布比较广泛,但不同地区其有效成分的含量有所不同,其有效成分的含量高低直接影响其

效果,而在荧光显微镜下可在木部薄壁细胞观察到一圈显著的绿色荧光,这可能是大青茎有效成分的存在部位,根据其荧光强度的不同可比较来源于不同地区的大青茎质量的优劣。

以往对生药粉末形态观察一般先采用水合氯醛透化,稀甘油装片后再在普通光学显微镜观察,由于受稀甘油等试剂的影响,观察效果不是较理想,且观察的结构形态一般平面状态;但是在荧光显微镜下操作步骤简便,生药不须试剂处理,可直接用粉末装片观察,由于无甘油等试剂干扰影响,其视野洁静,结构层次感较强。如所观察的晶纤维、木栓细胞等,因此,整体效果要优于普通光学显微镜。更重要的是,在荧光显微镜下,有些结构可发出荧光,如大青茎粉末含有的不同纤维发出的荧光及亮度不一样,为我们鉴别不同种类的生药提供了重要的依据。

3.3 不同显微镜观察大青新鲜叶结构效果的比较

荧光显微镜下观察新鲜大青叶片的下表皮,能够清晰地观察到气孔的数量及腺毛、非腺毛,其次在叶片上观察到其存在着一定数量的钟乳体,立体状的波纹状角质层细胞也很容易观察,另外可清晰地看到气孔的开合状态,在一定程度上利用荧光显微镜可代替扫描

显微镜观察上述叶片结构。关于气孔类型,已有的关于马鞭草科气孔的观察研究通过解离染色方法证明该科中气孔类型较为丰富,有直轴式、平周式、不定式等[5],但在荧光显微镜下叶片气孔的类型不好判别,因此其有一定缺陷,而据我们在光学显微镜下将大青叶下表皮撕裂后加蒸馏水后观察,大青叶气孔类型很容易就能被判断为无规则形,因此判别叶片气孔的类型还需利用将下表皮撕裂或解离后等方法再在普通光学显微镜观察才方便。

近年来,随着新技术的不断涌现,迅速地推动了中药或生药鉴定的

[9,10],关于生药显微鉴别仪器,常见的有普通光学显微镜、偏振光显微镜、扫描电子显微镜等,利用荧光显微镜进行化学成分组织定位也有报道[11],但最常见的仪器是光学显微镜,在鉴别生药方面荧光显微镜的使用还未见报道。我们利用荧光显微镜观察黎族药物大青茎粉末和新鲜叶片显微构造是一次成功的尝试,它为生药显微鉴定开拓了一条新的途径,且操作简便,无须任何试剂处理,保留了生药的原样,图像更加直观、清晰,值得深入研究。但也需要注意,有些部位荧光消失较快,需快速观察。本组资料只探讨了定性实验问题,其他涉及到如何对化学成分进行定量等问题还需继续探讨,但是至少我们知道化学成分存在的部位,这为我们继续改进实验提供了契机。由于本次研究材料中无淀粉粒结构,其结构在荧光显微镜下效果如何?有待下次在其他材料中研究。

【参考文献】

1 李艳,赵庆春,郭涛,等.大青根化学成分的研究[J].

药物化学杂志,2008,18(5):371373.

2 赵庆春,李艳,蔡海敏,等.大青根化学成分的研究(Ⅱ)[J].中国药物化学杂志,2009,19(4):280283.

3 何玉铃 ,郭昭麟, 高国清,等.板蓝根药材之鉴别研究[J].中医药杂志, 2001, 12(4): 267283.

4 刘明生. 黎药学概论[M].北京: 人民卫生出版社,2008.

5 朱栗琼,招礼军,陶世红,等. 马鞭草科9种植物叶表皮特征及其分类学意义[J].安徽农业

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9 陈月娥, 姚小华.中药鉴定新技术的发展概况[J].广州中医药大学学报,2007,24(4):346350.

10 李洁.浅谈几种显微技术在中药鉴定中的应用[J].国医

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11 秦玲 , 刘文哲. 补骨脂中呋喃香豆素类物质的积累

规律及组织定位[J]. 武汉植物学研究,2007,25(4):360365.

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