显微摄影技术之二

http://www.microimage.com.cntina(2011-03-16 10:39:00)

  显微摄影是一项重要的显微技术,同再现显微镜中物体影象的各种方法比较,显微摄影是最好的方法。它对以显微镜作为研究工具的研究人员是必备的手段,尤其在研究染色体及其分子特征时,就更加显得必要了。现在数码相机的问世,又使显微摄影变得更为简便,且效果好。在有关学术研究和理论探讨时,一帧好的显微照片,可以省去许多的文字描述,并且使人心悦诚服。何况在生物学领域中,确有不少问题的研究,必须借助显微摄影。

  下面,仅以植物染色体作为拍摄材料,概述显微摄影的基本方法,数码显微摄影的操作流程和传统的显微摄影基本一样,只是省去了底片和暗房技术,由计算机完成。

一、显微摄影对制片标本的要求

  染色体只见于有丝分裂和减数分裂的细胞核中,根尖、茎端、幼嫩花药和胚珠是镜检染色体的材料,尤以根尖和花药更为常用。观察染色体的形态、结构和数量,常用酶解或压片法制片。此法能保持染色体的完整,并能接近于活体状态。一张好的显微照片,来源于完好的染色体制片标本。适于拍照的制片标本,应具下列条件:

  1、选用标准的载玻片和盖玻片 光源入射光束,经载玻片透射标本,再经盖玻片进入物镜,处于光路之中的玻璃,应是表面无伤,内无气泡;外无霉斑。这样可以杜绝光线乱反射,防止阻光、降低亮度以及有损清晰度。载玻片厚度不宜超出聚光镜的焦距,一般在2毫米以内,可将光源的光束集中于载玻片的标本上。盖玻片的标准厚度为0.17毫米,若使用厚度大于工作距离的盖玻片,物镜前透镜会触及盖玻片,同时不能准焦;盖片厚,球差就大,会降低影象质量。有效盖片厚度,包括封固剂的厚度,即树胶或尤派胶用量,因此,封固剂要调稀,少许滴加一薄层。

  2、染色体处于相宜的时期,平展逸散,完整无损 染色体的计数和组型分析,以有丝分裂的中期(或晚前期),减数分裂的终变期和粗线期为宜。这时染色体收缩变短,呈典型状态,易识别。通过前处理的精细加工,染色体相互逸散,互不接触,并尽可能使之平展于同一水平面上,又不失细胞的完整轮廊(图3-1)。

  3、染色鲜明适度 染色体过染,染料堆积,使染色体模糊成一块,难以辨别细节,缺乏质感;染色体着色过浅,使影象不鲜明,辨认不清,反差不大。染色体染色以蓝紫为佳,色彩鲜明,胶片易感受,拍摄效果好。一般多用铁矾苏木精染色制片。当然,醋酸洋红和孚尔根反应也可以。细胞质染色应浅淡,以辨清细胞质的完整轮廓为准。常用铁矾苏木精过染,再用45%醋酸软化和分色,结果染色体着色蓝黑而鲜明,细胞质浅淡而不明显,增大了色彩的对比,扩大了影象的明暗反差。

  4、清洁无尘,消除气泡 制片中的灰尘异物和气泡,有损影象的质量,防碍观察。气泡为临时制片的常见弊病,小的气泡有碍观瞻;大的气泡连片,推挤染色体,堆积集中,损坏了好的影象。要随时滴加所用的临时封固液,消除气泡。


二、选用优质物镜和接目镜

  显微摄影是以接物镜和接目镜作为摄影镜头,其中接物镜尤为重要,物镜的分辨率就是显微镜的分辨率。目镜与显微镜的分辨率无关,它只有把物镜已放大的影象进一步放大,既使是最好的目镜,也无法观察到未被物镜分辨的细节。所以摄影时,物镜要严格选择,不可任意滥用。

1、物镜 接物镜种类繁多,光学性能相差悬殊。摄影时必须选用得当,绝非任一物镜皆可产生最佳影象。

  物镜由透镜组成。单片透镜具有多种象差,一个完善的物镜,是由一组复杂的透镜组成。按象差矫正程度,物镜可分消色差物镜,复消色差物镜,萤石物镜和平象物镜等类别。

消色差物镜,因制造容易,是最常见的物镜。金属外壳上不刻代表(图3-4左)。该物镜将光谱中红光和蓝光聚焦于一点,黄绿光则聚焦于另一点。其最佳清晰范围是在510μm(毫微米)绿光区至630μm橙光区间(图3-2Ach红)。消色差物镜性能较差,不适于显微摄影。因未经矫正的蓝光对感光胶片的乳剂膜非常敏感,全色胶片对未经矫正的红光也能感应。如果必须使用时,加用黄绿色滤色片,也可获得清晰的影象。

  复消色差物镜的性能很高,能将可见光谱中的红、蓝和黄光聚焦于一点,改正了红、蓝色光的球差和其他象差。最佳清晰范围从波长400nm至720nm(图3-2Apo线),容纳了全部可见光谱。适于任何色光下或加用各色滤色镜摄影,更适于彩色摄影。但是,复消色差物镜残留有象场弯曲,使平面物体形成类似球形弯曲的影象。结果使视野中心和边缘的影象不能同时准焦,给摄影带来不便。拍出的底片中心清晰边缘模糊或相反。象场弯曲可以通过选用特殊的目镜加以克服矫正。复消色差物镜的金属外壳,刻有“Apo”字样,供作识别(图3-3)。

  萤石物镜,色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间,故又可称半复消色差物镜。最佳清晰范围在波长430nm至680nm(图3-2 l线),包括了绝大部分可见光谱。适于黑白和彩色摄影,可加用各色滤色镜,物镜外壳刻有“F1”字样(图3-4右)。

  鉴于倍数愈高物镜的象场弯曲愈显著,歪曲影象,降低摄影质量,难以获得完美的底片。现今,已研制出清除象场弯曲的一系列平象物镜。平象物镜,校正了象正场弯曲,不存在视野中心与边缘不同时准焦的现象。由于将影象展平,在同样倍数下,有效影象要比一般物镜的影象稍大。为当今理想的摄影物镜,应积极选用。平象物镜有多种类别,外壳上刻有不同的字样,以资识别。如“Plan”(平象),“Pl”(广视野平象)、“NPl”(正常视野平象),“Planachromate”(平象消色差)、“Pl Apo”(平象昨消色差)等(图3-5)。

  物镜在使用时,按其前透镜与标本间介质的不同,分为干燥系和浸没系物镜。浸没系物镜外壳前端,常刻一黑环,以便识别。油浸物镜外壳刻有“Oel”、“Oil”、“Hl”字样;水浸系物镜刻有“W”、“Water”;甘油浸没系物镜刻有“Glyc”、“Glyz”,通常油浸物镜只有90×和100×(图3-6)高倍物镜。个别显微镜配有63×或40×的中倍油浸物镜,其中尤以63×的油浸物镜,质量最佳,非常适于显微摄影。在焦距和数值孔径相同时,浸没物镜的象差校正比干燥物镜完善,成象质量好。由于浸没液折射率大于空气的折射率,从而提高了物镜的分辨率。同时,这层介质可使入射物镜的光线提高,提高视野亮度。采用浸没物镜,可消除物镜前端透镜表面的杂乱反射光,减少有害的反射光量,使物体影象反差增加。

  2、目镜 目镜亦参与造象,把物镜映来的影象进一步扩大,并校正物镜余下的象差和色差。目镜作为投影器,把放大的影象投射在暗箱的焦平面上。目镜种类多,光学性能差异较大,一定类型的物镜必须选用一定类型的目镜相互组合。绝非只要有好的物镜,随便一种目镜都可用来摄影。

附有摄影装置的显微镜,备有摄影目镜,专用摄影,不宜作为观察用。这种目镜能较好的校正象场弯曲,提高成象质量。摄影目镜上刻有“Photo”、“FK”等字样。
平象目镜也是一种适于摄影的目镜。有专用摄影目镜,选用平象目镜配合平象物镜一起使用,可以获得很好的摄影效果。目镜刻有“Plan”、“Periplan”、“GF”、“GW”和“Kpl”等字样。

  3、物镜与目镜组合 为提高影象质量,消除象差和色差,在选配物镜和目镜组合时,从类别上进行选择,如用平象复消色差物镜和摄影目镜或平象目镜组合使用。此外,物镜的数值孔径和放大倍数,以及目镜的放大倍数,更要考虑这涉及有效放大率、分辨率、焦点深度和视野宽度等几个与摄影质量相关的问题。所以,选用物镜和目镜时,要考虑下述几个问题:

  (1)有效放大率:显微镜辨别微小物体和细节的能力,取决于分辨率,不在于放大倍数。分辨率决定于物镜,而与目镜无关。显微镜的有效放大率,为所用物镜数值孔径的500-1,000倍。数值孔径常简写为N.A.,其数值刻在物镜上。例如,使用数值孔径为0.65的40×物镜,其有效的放大倍数为325-650倍。为达此倍数,要选用8-16倍的目镜。高于16×目镜所得放大倍数叫做“空的放大”,对影象细节的分辨,没有丝毫提高。目镜倍数太低,总放大倍数太小,物镜分辨率不能充分发挥,本来可以辨认的细节,由于总倍数太小,挤在一起难以分辨。

  (2)分辨率:显微镜的分辨力决定于物镜数值孔径,孔径愈大,分辨率愈高。数值孔径与物镜倍数有关,请看下列数字:
物镜倍数 4× 10× 20× 40× 100×
数值孔径 0.1 0.25 0.40 0.65 1.25
上列数字表明,随着放大倍数的加大,数值孔径相应提高,分辨力随之增大,欲提高对物象细节的分辨能力和清晰度,必须使用高数值孔径的物镜。例如,拍摄染色体减数分裂前期Ⅰ的几个影象,非用高分辨率的油镜不可,摄影目镜应视物象的大小和视野宽度,选用低倍的目镜为宜。在这里要考虑物镜的数值孔径,不是总放大率,单纯考虑放大倍数,不顾及分辨率,就会出现摄影质量相差悬殊的结果。例如,用100/1.25物镜与4×目镜组合,总放大倍数为400倍,分辨距离为0.27微米;使用40/0.65的物镜与10×目镜组合,总放大倍数也是400倍,分辨距离下降到0.5微米。尽管总放大倍数相同,物象微细结构的分辨力几乎相差一倍。
  (3)焦点深度和视野宽度:焦点深度是指物象的某一点被准焦时,其清晰部分的上下距离(厚度)。焦深大,清晰的深度大,焦深小,清晰的深度小。染色体数目较多的植物,例如八倍体小黑麦2n=56,制片时难以把所有染色体平展一薄层,56条染色体纵横交错,散在不同的水平层次上。因此,若缺少足够的焦点深度,难把众多的染色体清晰地反映在同一张底片上。焦点深度与物镜的数值孔径和总放大倍数成反比。数值孔径小,放大倍数低的物镜和目镜,焦深长,只有选用数值孔径小和放大倍数低的物镜和目镜,加长焦点深度,才能把处于不同水平层次的染色体,清晰地摄入同一张底片内。
  视野宽度与显微镜的总放大率成反比,使用高倍物镜和目镜,视野缩小,难在同一视野内容纳一个细胞的全部染色体。改用低倍的物镜或目镜,降低总放大率,放大视野,以至能包括一个细胞的所有染色体止。
  综上所述,物镜数值孔径大,分辨率高,物象清晰,焦点深度和视野宽度降低,选用物镜和目镜主要着眼于提高物体影象的分辨率和清晰度,即选高数值孔径的平象复消色差中、高倍油浸物镜,兼顾焦点深度和视野宽度,并选用相宜的低倍摄影目镜或平象目镜。焦深和视野不足时,适当调换物镜,降低数值孔径或放大倍数。
三、光路合轴和光阑调整
  显微摄影采用中心亮视野透射照明法,照明光束中轴与显微镜的光轴在一直线上。光路系统始于光源,经视野光阑、孔径光阑、聚光镜、透明制片标本、物镜和目镜,将物体影象投射在暗箱的焦平面上。
  摄影前,光路要合轴调整,光束与显微镜的光轴,位于同一轴线上。光路系统中的目镜、物镜和孔径光阑,于固定位置,勿需调整,仅聚光器可变。因此,光路的合轴,实为聚光器的调中。
摄影要求视野亮度非常均匀,调整光源灯位置,使之照明于视野中央。
  当前,摄影和观察普遍采用科勒(Koehler)照明法,这是一种最佳的中心亮视野照明。
  1、聚光器和光源灯的调中 摄影前,要把聚光器和光源灯调中,使聚光器中心与视野光阑的中心处于同一光轴上。光源灯的灯丝,照明于视野中心。
聚光器的调中步骤:
  (1)转动聚光器升降旋钮,把聚光器升至最高位置;
  (2)接通光源灯的电源开关;
  (3)将被摄的制片标本,放在载物台上,用4×或6.3×低倍物镜聚焦在样品上;
  (4)缩小镜座上的视野光阑,在视野中可见边缘模糊的视野光阑图象(3-7);
  (5)微降聚光器,至视野光阑的图象清晰聚焦止(图3-8);
  (6)用聚光器两个调中螺杆推动聚光器,使缩小的视野光阑图象,调至视野中心(图3-9);
  (7)开放视野光阑,使多角形周边与视野边缘相接(图9-11);
  (8)反复缩放视野光阑数次,确认光阑中心和边缘与视野完全重合;
  (9)使聚光器回复顶点位置。

  要通过视野光阑,保证视野的照明强度和均一,必须进行灯丝的调中,使投射的光束和光轴合一,其调整方法如下:
  光源灯泡拧紧在灯座上,固紧于灯室或镜座中,转动灯座或灯室上的垂直、水平调节螺丝,使灯丝调中,位于视野中心(图3-11)。灯丝的图象,可于两处观察:一是在视野光阑上面的滤色镜座上,放一毛玻璃或乳白滤色镜,用以观察灯丝象的位置,至调中止;二是在物镜的后焦面上,聚焦后,从镜筒中取下目镜,在物镜的后焦面上,可见到灯丝的清晰图象。两法当中,前法可取,简便易行。

   灯丝的调中,可结合科勒照明法一并进行。
  2、科勒照明法 科勒照明法是当今显微摄影的最佳照明法,视野照光均匀,被摄物体不受热,影象清晰。新近的显微镜,照明系统已按科勒法设计装置,使用时稍加调整即达到最佳照明状态。
科勒照明法是光源的灯丝在聚光器的孔径光阑上成象。因此,也就在物镜后焦面上成象。这样视野内照光均匀,不会烤焦被摄材料,极为有效的控制被照明的视场及其照明孔径。
视野的照明强度,用升降电压调节。
  3、正确的使用光阑 显微镜有两种可变光阑,孔径光阑和视野光阑。正确的调整和使用光阑是保证摄影质量的重要环节。
  (1)孔径光阑的调节使用:孔径光阑与聚光镜是构成聚光器的两个重要部分。显微镜的性能主要决定于物镜的性能,而物镜的性能又决定于数值孔径。物镜的数值孔径与聚光镜的数值孔径相关,两者孔径相等时,物镜分辨力最高。聚光镜的数值孔径受孔径光阑控制,用孔径光阑的开放与收缩,调节聚光镜数值孔径的大小。
  显微摄影不同于一般摄影,其最大的区别是影象反差小,焦深浅。这两点可随孔径光阑缩小而提高。孔径光阑小于物镜的数值孔径时,物象的分辨力和亮度降低,但影象反差和焦点深度提高,便影象更加清晰。所以,在不过多地降低分辨力的前提下,把孔径光阑调到所用物镜数值孔径的60-70%大小是比较合适的。例如,物镜的数值孔径为1.0,孔径光阑的数值调到0.6-0.7,所以,显微摄影时,缩小孔径光阑,尽管丧失少许的分辨力,却提高了影象反差、焦点深度和影象的清晰度。
  孔径光阑的调节方法:当聚光器标有孔径的数字时,对准所需的值即妥,如果不具孔径光阑数值,在显微镜向标本聚焦后,从镜筒中取下目镜,在物镜的后透镜中可见孔径光阑影象。光阑缩小时,仅一见一亮点,逐渐开大光阑,亮孔扩大,直至需要的程度。当光阑缩小,视野亮度降低时,可适当提高电压增加照明强度。
  (2)视野光阑的调节:视野光阑位于镜座之中,用以控制照明光束的直径,缩小视野光阑,光束直径小于孔径光阑,视野亮度不足,影象不清晰;视野光阑开大,光束直径超出孔径光阑,因光线过多,造成光线的乱反射,影响影象的清晰度。视野光阑的适宜大小,以光阑的边缘外切孔径或孔径光阑内接视野光阑为度(图3-13)。

  总之,孔径光阑的调节,取决于所用物镜数值孔径。当两者相等,分辨力最高;孔径光阑小于物镜的数值孔径,影象反差和焦点深度增大。视野光阑随孔径光阑而变,总是外切孔径光阑。更换物镜,数值孔径改变,孔径光阑重新调整,视野光阑亦随之改变。
四、选用适宜的感光胶片
  感光胶片类别多,性能相差甚大,不是每种胶片都适于显微摄影。了解胶片的各种性能试拍后择优选用。一经选定,不要轻易改换,以保持拍摄质量的稳定。胶片的性能是胶片中直接决定和影拍摄质量的因素,如感色性,感光度和反差系数等,要从这些质量因素中选用适宜的胶片。
  1、感色性 是指胶片对不同色光的敏感程度,这是胶片最主要的性能。根据感色性,可把黑白胶片分为色盲片、分色片和全色片等不同的片种。
  色盲片:乳剂中除卤化银外未加入化学增感剂,只能感受可见光谱中的蓝紫两色,对其他各种色光不感受。感色范围为330nm-480nm的波长区(图3-14)。为一种低速感光片,银粒细,反差大,解象力高。适于黑白、蓝紫等色光影象的显微摄影,不能用以拍摄红、绿和黄等色的影象。胶片对这些色光不感受,在照片上呈黑灰一片,不能分辨。所以,用醋酸洋红和孚尔根反应的染色体标本,不能使用色盲片摄影,铁矾苏木精制片的标本可以使用色盲片。

  分色片:感光乳剂中加入了黄绿增感色素,除感受蓝紫色外,对黄绿二色也能感受,对红橙色光仍不能感受,感受范围为波长300μm-600μm区段(图3-15乙),除红橙色标本外,可广泛用于显微摄影,是一理想的显微摄影胶片,它不仅反差强,颗料细,并能记录出较多的亮度等级和较宽的感受范围。用醋酸洋红染色和孚尔根反应的标本,仍不能使用分色片拍摄。
  全色片:乳剂中添加了公演增感色素,对可见光谱的各波段色光能全部感受,故称全色片,感色范围为330-700μm(图3-15丙),共中对绿色光感应稍弱。胶片的银粒粗、感光速度快、反差小、黑白等级多。这些特点,会使显微摄影本来影象反差就小,黑白对比不鲜明的缺点更加突出。照片中的染色体不黑,背景不白,呈灰暗状态,使用感光底低(ASA50以下)的全色胶片,可获良好的效果。
  2、感光度 指胶片对光线作用的敏感程度,即感光速度。显微摄影对胶片的感光速度没有特写的要求,选用胶片时,考虑的不是速度本身,而是与感光速度相关的质量因素,凡属感光度高的胶片,乳剂的银粒粗、反差小、灰雾大、保存性差;感光速度低的胶片、银粒细、反差大、灰雾小,保存性好。所以,显微摄影力求使用低感光度的胶片,以便获得反差高、银粒细腻、清晰度高的摄影效果。目前,市场供应的GB21°(ASA50)全色胶片,不是理想的显微摄影用胶片,感光度在ASA100以下适于显微摄影。
  3、反差和反差系数 反差是指被摄物体景象中明亮部分与阴暗部分亮度差别的程度。胶片的反差,用反差系数表示。它是指胶片影象反差与被摄物体影象反差的比值。即:

  若胶片上影象反差大于物体影象反差,则胶片的反差系数大于1;胶片影象反差小于物体影象反差时,胶片的反差系数小于1。同一视野的相同影象,用不同反差系数的胶片拍摄,能拍出不同反差效果的底片。反差系数愈大,底片的影象反差愈强,黑白对比愈分明;反差系数愈小,底片反差愈弱,色调灰暗,影象黑白对比不鲜明。显微摄影选用高反差系数,对控制影象的质量是十分重要的。应作为选用胶片的重要质量指标。
  除上所述,胶片的有效期限、乳剂号、胶片牌号和制造厂家,也是选用胶片时,加以考虑的因素。
五、滤色镜的选用
  滤色镜是显微摄影必备的光学滤光元件,利用滤色镜对色光选择吸收的原理,通过控制色光,突出或抑制影象在胶片上的感应,以期获得理想的照相底片。
  黑白胶片的显微摄影,是把视野中的彩色影象,以黑白两色及其不同程度的灰色中间层次,将影象录在负片上。利用滤色镜控制照明光束的不同色光,调整影色的色调和反差,可拍出各种不同效果的底片,甚至拍出在反差和清晰度上优于原物体影象的底片。  

   一束白光,色散后形成红、橙、黄、绿、青、蓝和紫七种单色光。这段可见光谱的波长为400-700μm,为实际应用的方便,通常将该七种色光概括为红、绿和蓝三段。白光就是由这三种色光等量混合组成。而红、绿和蓝色光的不等量混合,会形成各种不同的色光。
  在摄影中,通常把红色光、绿色光和蓝色光称作三原色光。把蓝光与黄光、绿光与品红光、红光与青光称作三对互补色光,这三对互补色光分别相加皆可得到白光、黄、品红和青三色,就称为红,绿和蓝三原色的补色。
  滤色镜对各种色光有选择吸收的特性,凡与滤色镜颜色相同的色光则能透过,而与滤色镜颜色互补的色光则被吸收。例如,绿滤色镜,在白光下把光谱中的蓝色光区段和红色光区段全部吸收,只让绿色光段的色光透过,滤色镜显示绿色。黄滤色镜吸收蓝色光,透过红光和绿色光。红滤色镜,把光谱中由绿到红段的光波全部吸收,只让红色的一段光透射。蓝滤色镜吸收了由红到绿段的色光,仅让红色的一段光透射,蓝色滤色镜吸收了由红到绿段的色光,仅使蓝色光通过(图3-15)。
  在显微镜的光路上,加用滤色镜,从白光中减去与滤色镜颜色互补的色光,使改变的色光透射物体,造成影象色调和反差的改变。显微摄影利用滤色镜提高影象的反差和清晰度,以获得理想的底片,被摄物体反射出来的色光,如果被滤色镜透过,在黑白底片上产生相应的密度,印放出照片,这部分影调,比较明亮,假若该色光被滤色镜吸收,底片上的密度就薄,制出的照片影调就暗。
  为提高影象反差,选用滤色镜的原则:选用与被摄物体吸收的色光同一颜色的滤色镜,即选用被摄物体的补色滤色镜,则可达到理想的最佳影象对比。因为视野中的物体影象的色调和反差,可被补色的滤色镜加强,而被同色的滤色镜所削弱。举例说明如下:
  染色体用铁矾苏木精染色,呈蓝色,这种蓝色染色体,吸收红光和绿光,透过蓝光。摄影时加用蓝色的补色──黄色滤色镜,可把照明光线中的蓝色光吸收,通过的是黄色光,滤色镜透射的色光,恰好是染色体吸收的色光,致使透射在染色体上的黄色光全被吸收,不再作用在底片上。染色体在冲洗后的底片上呈白色,其他部分为黑色。印放照片,将是深黑色的染色体,散在光亮的白色背景上,影象清晰,黑白分明。
  又如,在孚尔根反应中,染色体呈阳性,显品红色,非DNA部分不着色。拍摄时,加用品红色的补色──绿色滤色镜,它吸收红光和蓝光,透过绿光;品红色的染色体,透过红光和蓝光,吸收绿光,滤色镜透过的色光,恰是染色体所能吸收的色光,因而造成了最佳影象反差。
  对双重染色的染色体标本,拍摄时选用突出重要影象的滤色镜。例如,用孚尔根反应外加固绿,染色体染成品红色,细胞质部分呈绿色。加用绿色滤色镜,则突出品红色,削弱绿色。
  总之,显微摄影选用滤色镜,取决于染色体的染色。如果滤色镜只透染色标本所能吸收的光谱,或滤色镜的透射曲线与标本的吸收曲线相同,即选用补色的滤色镜,定会达到理想的最佳影象对比。
  此外,尚须提及的一点:摄影时选用被摄体同色的滤色镜,可提高影象的分辨率。
滤色镜只限于用全色胶片拍摄时使用,不能到处滥用。对于只有黑白或灰色的物体影象,由于均匀的吸收或透射各种色光,滤色镜在此不起作用。
六、拍摄
  拍摄是显微摄影系列操作中的关键环节,在镜检观察中,发现必须摄下的影象,应即时拍照。
拍摄前,做好系列的操作准备,具体方法已在前面述及。例如,摄影物镜和目镜的合理组合,光路合轴,科勒照明,合理加用滤色镜,调准孔径光阑和视野光阑以及应用低速全色胶片等。这些操作,彼此相关,缺一不同。然后转入取景、聚焦和曝光拍摄。
  1、取景和聚焦 显微摄影要通过摄影装置的侧视目镜取景器,对准拍摄的物体影象,选取适宜的物象进行拍照。
  (1-)屈光度调节:取景聚焦前,首先进行屈光度调节,使目镜取景器适于各种不同视力者,达到准确的聚焦。在显微摄影装置的接头部位,有一则视目镜取景器(图3-16),它由数片透镜组成,近眼端为屈光度调节环,能左右转动,变换透镜间距,改变焦点距离,调节环旋转调节的最大范围为±5屈光度(一屈光度相当于眼镜的100度)。经过调节,使近(远)视眼在500度以内的人,可脱下眼镜取景对焦。

双十字线校准后,要保持不变,不能随意变动,以防焦距改变。取景聚焦,只需使用显微镜调焦螺肇。屈光度调节,仅改变目镜取景器的长度,不涉及被摄物体至暗箱焦平面的距离,当十字被看成双线时,聚焦的影象焦点,能清晰地投射在焦平面上;如果十字线被看成单线,既使影象是最清楚的准焦,其焦点并不落在暗箱的焦平面上,而位其前后,底片影象模糊不清,当改变拍摄者或左右眼调换使用时,皆需重新进行屈光度调节。
  (2)取景:取景决定拍摄的对象、范围和大小。专用摄影设备,用侧视目镜取景器取景,在刻有双十字线的玻璃屏上,同时刻有数种规格的长方形取景框(图3-18)。底片所能摄下的范围,并非视野所见的全部,仅是圆形视野中的长方形部分,在可供系列暗箱共同使用的取景器中,有数种规格的取景框,取景时要准确使用,务使报用暗箱的规格与取景框的大小相符。

   拍摄的物体一经确定后,即要考虑拍摄的范围和大小(放大倍数)。例如,拍摄减数分裂的同步性,为展示植物花粉母细胞在花药中同步地进行减数分裂,拍摄的范围应大,在一张底片上,要有足够数量的同步分裂的花粉母细胞,以数量突出同步性。这时选用低倍的物镜和目镜拍摄。作为染色体计数和组型分析的摄影,拍摄的范围要小,每片要拍全一个细胞的染色体,尽可能利用取景框所能提供的范围,提高放大倍数,使染色体民取景框相接。
  取景时,要使被摄的物体影象中心位于长方形取景框的对角线中心,并使两者的长、短相应(图3-19)。需要90°调整时,转动载物面或摄影装置,让影象长轴和取景框横轴平行。影象的大小用调换物镜和目目镜控制。
  (3)聚焦:转动显微镜的粗细调焦螺旋,改变物镜前透镜和被检物体的距离,使视野中物体影象的焦点聚于暗箱的焦平面上。
纵横移动镜台的制片标本,寻找拍摄的图象;上下转动调焦螺旋,辨清染色体的细微结构,取景聚焦,需几经反复,底片影象的清晰度决定于拍摄前的最终一次准焦。
  取景聚焦完毕,立即揿下快门按钮,任何有关操作,都要在聚焦前完成。准焦的微小颤动,也会引起焦点的改变,致使拍出的底片影象模糊不清。使用135或120胶片拍摄,卷片在在聚焦前完成,尤其使用镜臂升降的显微镜更应注意。
  加放滤色镜务在聚焦前置于镜架上,如在聚焦后加用,会使焦点改变,影象不清。
摄影暗箱的焦平面要与载物台平行,否则调焦后的影象,不会垂直地投射到胶片上,致使影象部分清晰,部分模糊。
  拍摄有丝分裂中期染色体,要对准两个染色单体间的空隙部分聚焦;具各种分带的染色体,亦可对准带纹准焦。同一细胞内的各染色体,往往不易分散在同一水平上,多少有一个深度和或层次。对此,要聚焦在中层的染色体上,力争物镜和目镜所能予的有限的焦点深度,以期扩大清晰范围。当然,降低物镜的数值孔径,亦可提高焦点深度。
  用4×或更低的物镜拍摄,由于焦点深度大,影象在很大的深度内都保持清晰,致使难以做到准确的聚焦。为此,要把聚焦望远镜装上目镜取景器上,借以聚焦。聚焦时,将望远镜的焦距调至无限远处,重新进行屈光度调节。待看清两条平行的十字线再转入调焦操作。
  使用单张散页片暗箱摄影,先把暗箱拉盖抽出,稍待片刻,稳后聚焦。
  2、曝光 曝光是显微摄影技术上的关键。曝光最重要的问题就是判定曝光时间,确定曝光所用的快门速度。显微摄影的视野,亮度变化极大,曝光时间的变化辐度甚大。正确的估计曝光时间,比普通摄影要困难得多。常用的估计影象亮度来确定曝光时间的方法,往往因光强度的特大变化,人眼对光的强度不会有科学的定量能力,致使发生错误。
  曝光过度,使底片密度很大,浑暗不清,没有透明的地方,丧失影纹细节;在最小密度部分灰雾密度大,底片反差小;曝光不足,整个底片密度很小,比较透明,虽然最大密度部分影纹分明,但最小密度和灰雾密度一样,没有影纹存在,缺乏正常的反差。这类底片,根本不能印放出合格的照片。
  影响曝光的因素很多,其中包括:被摄物体的颜色和光学必须、物镜的数值孔径和倍数、目镜倍数、胶片的性能、滤色镜的颜色、光源强度和色温等因素。下面概述几个主要因素,除胶片感光速度是表示对亮度的敏感强度外,考虑其余因素的共同着眼点,就是分析它们对被摄影象的亮度是加强还是削弱。
  (1)照明光源:光源灯是显微摄影的照明光源,它有数种,照明强度和色温各不相同。
  低压钨丝白炽灯为常用的照明光源,灯泡很小,便于使用,灯丝聚成球状,颇似点光源,光线易会聚成束,强度较大。所用电压6-12V,功率5-60W,以6V15W的灯泡最常见。灯丝发出的光谱成分和光量,决定于它的色温,色温越高,发出的光量越大,光谱成分中蓝紫的比例增多。色温与电压有关,电压升高,光量愈大,色温提高,蓝紫光成分增多(图3-21)。6V15W灯泡较之12V60W灯泡,无论在色温和发光量上,都相差较大。显微摄影的曝光时间,按所用光源强度而定,电压高,功率大的灯泡,照明强度高,蓝紫光多,使胶片感光快,曝光时间要短。与其他光源相比,钨丝白炽灯的发光,红橙光多,蓝紫光少,所以灯光显黄色。发出的光为连续光谱,加上适当的滤色镜,可得到可见光谱中的任一单色光。

  卤钨灯为一新型光源灯,发光效率高,照明强度大。灯泡小,石英玻璃外壳,发光灯丝近点状,色温在3000°K以上,发光稳定,比功率相同的钨丝白炽灯亮得多。胶片感光快,曝光时间要短。卤钨灯的光谱曲线也是连续光谱,常用12V50W和12V100W的灯泡。适于显微摄影照明用。
  氙灯,亦属新型光源灯,是在充氙气的石英玻璃管内装上钨丝电极制成。显微摄影照明用的是一种短孤氙灯,为一种亮度极高的点光源。多采用20V150W的氙灯照明。氙灯也是连续光谱,在可见光区,各种波长能量大致相等,色温6000°K左右,近于日光的白光。适于显微摄影,尤其适于日光型彩色胶片摄影。
  (2)胶片的感光度:目前,很多单位显微摄影所用的感光胶片,大多为ASA100(21DIN)的全色胶卷。胶卷的感光度直接影响曝光时间,ASA感光标准,其数值相差一倍时,胶片的感光时间也相应地相差一倍。例如,ASA100的胶片,正确的曝光时间为1/15秒,ASA50的胶片则曝光1/8秒,而ASA200的胶片只需曝光1/30秒。余类推。DIN制感光标准,每差三个数值,胶片感光时间相差一倍。如21°DIN胶片,正确的感光时间为1/15秒,24°DIN胶片只要曝光1/30秒,18°DIN的胶片要用1/8秒,我国的胶片感光标准“GB”制同于“DIN”制标准。使用胶片时要注意:同一感光度,不同牌号的胶卷,如“上海”GB21°胶卷与“南方”GB21°胶卷,其实际感光度不尽相同,既使同一牌号的胶卷,不同时期的产品(乳剂号不同),在性能上会有稍许的差异,胶片超过有效期,或保存条件不佳,胶片的感光度会降低,使用时要酌情增加曝光时间。
  (3)物镜的数值孔径和目镜的放大倍数:曝光时间取决于视野中的影象亮度,影象亮度与物镜、目镜的性能相关。物镜的数值孔径大,进光量多,影象亮度大,曝光时间要短;目镜放大倍数大,视野相对加大,影象的亮度相应的减小,曝光时间要长。总之,曝光时间与有效的物镜的数值孔径的平方成反比、与目镜的放大倍数的平方成正比。
  (4)滤色镜的颜色:滤色镜具有滤光的作用,光源投射的光束,经滤色镜的选择吸收,仅有部分色光透射,减弱了光源的照明强度,其减弱的程度,因滤色镜不同而别。被滤色镜减弱的光强度,在摄影时必须给予补偿,以达正确的曝光。一般用滤色镜的因数表示,所谓因数就是用某种滤色镜后,应在曝光时间上增加的倍数或曝光补偿倍数。但是补偿的倍数不是固定不变的,因数可随条件不同而改变。例如,使用全色胶片拍摄,因对全部可见光的各种色光都感受,加用黄滤色镜,仅吸收蓝光,红光和绿色都可透过,所以因数小,即补偿倍数小,加用红滤色镜,吸收了绿光和蓝光,仅透过红光,滤色镜的因数大,即曝光补偿倍数大。同色滤色镜的因数亦不同。光源色温高,照明光线中蓝紫光多,加用黄滤色镜,吸收的色光多,因数大;光源色温低时,照明光线中红橙光多,蓝紫光少,黄滤色镜吸收的色光相对减少,所以因数小。
  一般情况下,使用全色胶片时,黄滤色镜的因数小,蓝、绿和红滤色镜的因数大,适宜的曝光补偿倍数,要通过试拍解决。中黄滤色镜的补偿倍数为1-1.5左右,中绿滤色镜为2左右。
  (5)被摄物体的染色和光学性质:视野中影象的染色和反射光情况,也是影响曝光的因素。染色体染色适度,分色好,清晰醒目,背景透明,反差大,曝光的宽容度大,易拍出感光适宜的好底片。染色过深,分色不好,染色体被染料堆积,微细部分辨不清,底色深,背景浑暗,通透性不好,曝光时间要长。染色浅淡,染色体不鲜明,与背景区别不大,反差小,曝光时间要短。后两类材料难以拍出好的底片,除非是奇缺,否则,应弃之不顾,不值得拍。
  被拍物体染成蓝紫色,较之其他染色,易拍出好的底片。红、黄和绿,因胶片对其敏感性较差,难以拍出理想的底片。
  总括上述诸因素,决定出准确曝光的快门速度。调准速度后,边取景聚焦,边持快门线,待准焦后,立即揿动快门按钮,快门开启胶片感光。曝光时严防振动,按动快门,不要用力过猛,低速曝光的轻微颤动,也会使底片上的影象模糊不清。
  目前,从摄影设备的设计制造上,已能完全保证准确曝光。如在光电元件控制下的自动曝光或用曝光表测定后的曝光,都可拍出感光准确的底片。但是,由于设备的限制,当前尚不能普遍采用,大量地还是手工操作的摄影装置。在完全手控条件下,只要多拍,精心钻研,长期地记录对比,达到正确的曝光是不难的。因此,严格控制光源的电压,使照明强度保持相对稳定状态,在一定的物镜、目镜组合下,调节使用与之相应的光阑开度,科学地运用滤色镜,保持使用同一种胶片,并能熟练地掌握显影技术,就一定能拍出理想的底片。
更多相关搜索: