蛋白质含量测定(考马斯亮蓝 G - 250 法)

http://www.microimage.com.cnMiffy(2011-01-26 11:17:19)

  一、目的

  蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一,承担着各种生物功能。蛋自质的定量分析是蛋自质构造分析的基础,也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质,提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝 G- 250 法是比色法与色素法相结合的复合方法,简便快捷,灵敏度高,稳定性好,是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝 G - 250 法测定蛋白质含量的原理,了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。

  二、原理

  考马斯亮蓝 G - 250 是一种染料,在游离状态下呈红色,当它与蛋自质结合后变为青色。蛋白质含量在 0 - 1000ug 范围内,蛋白质一色素结合物在 595 nm 下的吸光度与蛋自质含量成正比,故可用比色法测定。

  三、仪器、试剂和材料

  1、仪器
( 1 )分析天平
( 2 )具塞刻度试管 10ml X 8
( 3 )吸管 0 . 1 ml X 1 , 1 ml X 2 , 5 ml X 1
( 4 )研钵
( 5 )漏斗
( 6 )离心管 l0ml
( 7 )容量瓶 10ml X 1
( 8 )离心机
( 9 ) 721 型分光光度计

  2、试剂
( 1 )标准蛋白质溶液 称取 10mg 牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至 100ml ,制成 100ug/ ml 的原液。
( 2 )考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂 称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250 ,溶于 50ml 90 乙醇中,加入 85 %( m/v )的磷酸 100ml ,最后用蒸馏水定容到 1000 ml 。此溶液在常温下可放置一个月。

  3、材料
绿豆芽

  四、操作步骤

  1、标准曲线的制作
取 6 支具塞试管,编号后,按下表加入试剂。


  盖上塞子,摇匀。放置 2min 后在 595 nm 波长下比色测定(比色应在 1h 内完成)。以牛血清白蛋白含量( ug) 为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。

  2、样品中蛋白质含量的测定
( 1 )准确称取约 200mg 绿豆芽下胚轴,放入研钵中,加入 5ml 蒸馏水在冰浴中研成匀浆,离心 (4000r/min, 10min), 将上清液倒入 loml 容量瓶,再向残渣中加入 2ml 蒸馏水,悬浮后再离心 l0min ,合并上清液,定容至刻度。
( 2 )另取 1 支具塞试管,准确加入 0.1ml 样品提取液,再加入 0.9ml 蒸馏水, 5ml 考马斯亮蓝 G- 250 试剂,充分混合,放置 2min 后,以标准曲线 1 号试管做参比,在 595 nm 波长下比色,记录吸光度。

  五、结果处理
  根据所测样品提取液的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋自质含 (ug) ,按下式计算:

  六、注意事项
比色应在出现蓝色 2min -1 h 内完成。

  七、思考题
1、考马斯亮蓝 G - 250 法测定蛋自质含量的原理是什么?还有哪些蛋自质定量法?
2、如何正确使用分光光度计?

  参考文献

陈毓荃.生物化学研究技术.北京:中国农业出版社, 1995
鲁子贤.蛋白质化学.北京:科学出版社, 1981
文树基.基础生物化学实验指导.西安:陕西科学技术出版社, 1994
张龙翔.生物化学实验技术.北京:人民教育出版社, 1981

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