MTT相关技巧汇总

http://www.microimage.com.cnMiffy(2011-01-25 15:41:54)

  (一)实验前应明确的问题

  1、选择适当的细胞接种浓度。

  一般情况下, 96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 105 个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行 MTT 试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证 MTT 结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。


  2、药物浓度的设定。

  一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。


  3、时间点的设定。

  在不同时间点的测定 OD 值,输入 excel 表,最后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。

  4、培养时间。

  200ul 的培养液对于 10 的 4 ~ 5 次方的增殖期细胞来说,很难维持 68h ,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期而趋于静止,影响结果,我们是在 48h 换液的。


  5、MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。

  做 MTT 时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高。


  6、理论未必都是对的。

  要根据自己的实际情况调整。

  7、实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。

  调零孔加培养基、 MTT 、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、 MTT 、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。

  8、避免血清干扰。

  用含 15 %胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于 10 %胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。

  (二)实验步骤

  贴壁细胞:

  1 、 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入 100ul, 铺板使待测细胞调密度至 1000-10000 孔,(边缘孔用无菌 PBS 填充)。

  2 、 5%CO2 , 37 ℃ 孵育,至细胞单层铺满孔底( 96 孔平底板) , 加入浓度梯度的药物 , 原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药 , 一般 5-7 个梯度 , 每孔 100ul, 设 3-5 个复孔 . 建议设 5 个,否则难以反应真实情况

  3 、 5%CO2 , 37 ℃ 孵育 16-48 小时,倒置显微镜下观察。

  4 、 每孔加入 20ulMTT 溶液( 5mg/ml ,即 0.5%MTT ),继续培养 4h 。若药物与 MTT 能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用 PBS 冲 2-3 遍后,再加入含 MTT 的培养液。

  5 、 终止培养,小心吸去孔内培养液。

  6 、 每孔加入 150ul 二甲基亚砜,置摇床上低速振荡 10min ,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。

  7 、 同时设置调零孔(培养基、 MTT 、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、 MTT 、二甲基亚砜)

[next]悬浮细胞:

  1 )收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度 1×106/ml ,按次序将 ① 补足的 1640 (无血清)培养基 40ul ; ② 加 Actinomycin D (有毒性) 10ul 用培养液稀释 l?g/ml ,需预试寻找最佳稀释度, 1:10-1:20) ; ③ 需检测物 10ul ; ④ 细胞悬液 50ul (即 5×104cell/ 孔),共 100ul 加入到 96 孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加 100?( 储存液 100 1640 )。

  2 )置 37 ℃ , 5%CO2 孵育 16-48 小时,倒置显微镜下观察。

  3 )每孔加入 10 ul MTT 溶液( 5 mg/ml ,即 0.5%MTT ),继续培养 4 h 。(悬浮细胞推荐使用 WST-1 ,培养 4 h 后可跳过步骤 4 ),直接酶联免疫检测仪 OD570nm ( 630nm 校准)测量各孔的吸光值)

  4 )离心( 1000 转 x10min ),小心吸掉上清,每孔加入 100 ul 二甲基亚砜,置摇床上低速振荡 10 min ,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD570nm ( 630nm 校准)测量各孔的吸光值。

  5 )同时设置调零孔(培养基、 MTT 、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、 MTT 、二甲基亚砜),每组设定 3 复孔。

  (三) MTT 的配制

  MTT 一般最好现用现配,过滤后 4 ℃ 避光保存两周内有效,或配制成 5mg/ml 保存在 -20 ℃ 长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把 MTT 粉分装在 EP 管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多 , 尤其当 MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了。

  MTT 有致癌性,用的时候小心 , 有条件最好带那种透明的簿膜手套 . 配成的 MTT 需要无菌, MTT 对菌很敏感;往 96 孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉 .

  配制 MTT 时用用 PBS 溶解 , 也有人用生理盐水配, 60 ℃ 水浴助溶。

  PBS 配方 :Nacl 8g , Kcl 0.2g , Na2HPO4 1.44g , KH2PO4 0.24g ,调 ph 7.4 ,定容 1L 。

  (四)关于细胞的接种

  细胞过了 30 代以后就不要用了 , 因为状态不好了 ; 培养板要用好的(最好进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。

  接种时最好按照预实验摸索出的密度接种 , 因为细胞密度在 10000/ml 左右时,所测得的 OD 值的区间即细胞抑制率(或者增值率)的所呈现的线性关系最好,结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡,因为细胞长的太快营养会不够,最后导致死亡。且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。故而 MTT 细胞密度多采用 10000/ml , 100ul/ 孔。

  细胞密度要根据不同细胞的特点来定 . 如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度,如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度,这样与对照的区别更明显,数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到 105, 贴壁细胞可为 103-104 。

  (五)加入 MTT

  个人认为 MTT 最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的 MTT 的适当比例,具体细胞数目和真正起作用的的 MTT 之间的关系确实不好确定,我认为 MTT 多加比少加好一些。

  MTT 的量各家报道不同,一般是过量的,所以 10ul 即够了。如果不使用 96 孔板,培养基超过 100ul , MTT 按照 10% 的比例加入 . 加入 MTT 以后振荡一下让 MTT 与培养基混匀,不过这个应该关系不大。

  如加入 MTT 后都有个别孔立即变为蓝黑色,则污染的可能性極大 , 另外 MTT 稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜 . 且在加 MTT 前可以先在镜下观察,看看是否有孔染菌,染菌的孔常常是临近的,因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应,所以可以单独将药物和 MTT 加在一起,看会不会起反应。如果不起反应,就不用去除含药物的培液,直接加 MTT 即可。

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