细胞凋亡试验常用的方法

http://www.microimage.com.cnMiffy(2011-01-25 15:22:52)

  (一)药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法:

  l 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L,在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。

  l 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组,设加完全培养基不加药物的阴性对照,并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照,每组均设4-6个复孔(平行孔)、37℃、5% CO2继续培养。

  l 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT(5g/L),培养4-6h后,阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应,于37℃存放过夜。

  l 用酶标仪在A570波长下测吸光度值,按下式计算抑制率

  抑制率(%)=(1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值) x 100%。

  (二)荧光法:

  l 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞,培养细胞48h后,收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。

  l 弃去固定液,并用PBS洗2次后,用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI荧光染色60min,用PBS冲洗3次,取10ul滴片,干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。

  (三)DNA琼脂糖凝胶电泳法:

  1、DNA提取:

  l 用大方瓶培养肿瘤细胞,每瓶10ml,细胞浓度为3 x 108个/ml,每隔药物浓度、作用时间均设2瓶,共分3个时间段,4个药物浓度。共培养26瓶细胞。

  l 分别于细胞中加入不同浓度的药物,于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h,收货细胞,用PBS洗2-3次。

  l 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中,加1ml细胞裂解液,再加蛋白酶K,轻轻振摇使悬液混匀,成黏糊状,50℃过夜。

  l 冷却后加入等体积的饱和酚溶液,混合后10000r/min离心10min,吸出上层水相,移至另一离心管中,再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次,直到无蛋白为止。

  l 吸上清加入氯仿/异戊醇(24:1)按上述方法再抽提一次。

  l 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液,混匀。

  l 再加入2.5倍体积冷无水乙醇,混合置-20℃处理30min后,10000r/min离心10min,沉淀部分为提供的DNA,弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次,将离心管倒扣在吸水纸上,吸干乙醇。

  l 加入200ulTE缓冲液融解DNA,再加入25ul的RNA酶,置37℃作用30min,置4℃冰箱保存。

  2、琼脂糖凝胶电泳:

  l TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解,待冷却至60℃时,加入溴化乙锭,使其终浓度为0.5mg/ml,混匀后灌胶。

  l 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内,使TBE电泳液盖过凝胶。

  l 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4:1比例混匀后点样。

  l 60V电泳1h,用紫外透射仪观察梯形条带。

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  (四)透射电镜形态学观察法:

  l 收集药物作用后最佳凋亡时期的凋亡肿瘤细胞,细胞总量大于10^6个,用PBS洗2遍后用3%戊二醛固定1h,PBS洗2次,再用1%锇酸固定1h,丙酮酸梯度脱水。

  l 细胞用树脂包埋,并进行超薄切片,用醋酸钠-枸橼酸铅染色,透射电镜下观察凋亡的细胞形态,可见有染色质浓集,不均匀分布,考核周边形成有核膜包裹的断裂核碎片,呈新月形凋亡小体,并选择典型切片图像摄影。

  (五)流式细胞仪检测法:

  1、原理:

  处于增殖周期中的细胞,根据其所处不同周期时相其DNA含量分布在2n-4n之间,发生凋亡的细胞内与核内DNA裂解成许多小片断,用细胞膜通透法可使小分子量的DNA片断穿过薄膜而丢失,仅剩下大分子量DNA片断,这些失去部分DNA的细胞可形成一个DNA含量小于2n的分布区,称“亚G1峰”,即AO峰(凋亡峰)。

  2.特点:

  l 经济简便,仅需单一染色。

  l 可判断凋亡细胞发生于哪一周期。

  l 可定量测定凋亡率,结果客观可信。

  l 用同样本可同时进行“亚G1峰”测定及DNA凝胶电泳。

  3、方法步骤:

  l 收货不同剂量药物作用于各不同时期的肿瘤细胞,细胞总数应大于10^6个,用PBS洗2次,加入70%酒精固定,4℃存放。

  l 染色前用PBS离心沉淀去除固定液,并用PBS洗1-2次,加入200ulRNA酶,37℃水浴30min。

  l 每毫升细胞悬液中加入碘化丙锭(PI)染液100ul混匀,置4℃避光30min,用流式细胞仪进行细胞周期分析,低于G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。测定“亚G1峰”值和细胞凋亡率。

  除上述常用的方法外,还可采用

  l ELISA法。其凋亡的断裂核可与抗组蛋白抗体及抗DNA抗体混合物反应后形成双抗体“夹心”结构,再经酶显色也可判断。

  末端转移的酶标记技术,利用核裂解碎片含有3/-OH的末端,在末端转移酶作用下加入已标记的核苷酸,在3/-OH末端上合成一段含标记的尾巴,再经酶显色或用荧光抗体显示出来。

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