培养细胞的常规检查和观察方法

http://www.microimage.com.cnMiffy(2011-01-25 14:54:50)

  细胞培养后,需要对其生长状况、形态甚至生物学性状连续地进行观察。由于细胞小而复杂,若不借助适当的手段,则难以观察期形态、结构,更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前,已有多种研究细胞的技术,从光学显微镜到电子显微镜,从一般细胞化学法到免疫化学法。

  细胞在体外培养过程需要每天进行常规检查和显微镜观察,及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、污染、培养基pH值是否变酸、培养基变黄是否需要更换等。细胞常规检查观察的方法有4种。

  一、肉眼观察

  一般常规检查用肉眼即可观察,主要看培养基的颜色和透明度的变换。正常情况下,培养基pH值介于7.2-7.4之间,呈桃红色,清亮透明。加入细胞在培养瓶中置一般恒温箱培养时,随着细胞生长时间的延长,细胞代谢产生的酸性物质会使培养基pH值下降,引起颜色变浅变黄。在超越缓冲范围后便宜酸化变黄,如不及时调节pH值,会影响细胞的生长,甚至造成细胞退变死亡。所以,一旦发现培养基变黄,应及时换液传代。一般更换培养基的时间依营养物的消耗而定,正常情况生长稳定的细胞2-3天换液一次,生长缓慢的细胞3-4天换液一次。培养基中加Hepes或用5%CO2恒温箱培养可使pH值维持稳定,利于细胞生长。用磷酸盐缓冲系统培养时,可因瓶及塞子漏气,CO2溢出,也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物,是培养基变碱发红,致使细胞难以生长,甚至死亡。细胞换液传代后,若发现培养基很快变黄,要注意是否有细菌污染或培养皿没有洗干净。贴壁细胞污染,也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。

  二、显微镜观察

  生长良好的细胞,在显微镜喜爱可观察到细胞透明度大,折光性强,轮廓不清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。若细胞生长状态不良,可见细胞轮廓增强,细胞折光性变弱,细胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质,细胞之间空隙增大,细胞形态不规则,甚至失去原有细胞的特点,产生园缩脱落,有时细胞表面及周围出现丝状絮状物。若细胞营养不良状况没有得到及时纠正,进一步发展可见到部分细胞死亡,崩解漂浮在培养基中,发现这种情况应及时处理,只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。

  三、细胞的生长状态观察

  细胞培养时,经初代培养或传代培养,都有一个长短不同的潜伏期,在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态极为重要。各种细胞增殖的时间不尽相同。传代细胞系,胚体组织或幼体细胞潜伏期短,一般在接种培养第2天即可见细胞生长增殖,3-4天便可连接成片。成体组织的潜伏期,老年组织和癌组织潜伏期更长,可达1周左右。原代细胞培养中最先可见组织块边缘“长出”细胞,这种细胞是从原代组织块中游走出来的,并不是细胞增势产生的。这种早期游离出的细胞多以成纤维细胞为主,易生长,适应性强,呈放射状或旋涡状分布,很快生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后,一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期、对数生长期、细胞大量繁殖、逐渐相连成片而长满瓶底。一般发现细胞覆盖瓶底的80%就应及时传代,否则会影响细胞生长甚至导致细胞脱落。当发现悬浮细胞生长显著、密度增大、分布稠密、培养基变黄也应及时传代。

  四、微生物污染的观察

  细胞接种、传代、换液加药后经常观察,密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养基浑浊、液体内漂浮着菌丝或细菌,或生长明显变缓,胞质内颗粒增多,有中毒表现等应怀疑是否有微生物污染,进一步观察检查并及时处理。

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