DNA荧光染色法检测细胞培养中的支原体污染

http://www.microimage.com.cnMiffy(2010-12-06 17:11:40)

  没有被支原体污染的细胞

  被支原体污染的细胞

  原理:利用荧光染料(bisbenzimide,Hoechst33258)检测支原体污染。这种染料会结合到DNA的A-T福集区域,因为支原体的DNA中A-T含量高(55%-80%),所以可将其染色而检测。被支原体污染的细胞经染色后在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点,即为支原体的DNA,证明有支原体污染。

  特点:简单、经济与灵敏,广泛使用,可作为例行的检测手段。可以检测不易培养的支原体,例如M.hyorhinis,比直接培养法快,约一周既可知道结果。

  缺点:有时会有背景荧光,影响结果判断。

  材料:

  Hank's balanced salt solution (不含NaHCO3 和酚红,HBSS,GibcoBRL 21250-014)、二苯并噻唑(bisbenzimide,Hoechst No.33258,Sigma B-2883)、thimerosol(Sigma T-5125)、0.1M柠檬酸、0.2M磷酸氢二钠、甘油、冰醋酸、甲醇、无菌水、chamber slide(Nunc 177380)或其替代物:35或60mm细胞培养皿内放无菌22x22mm盖玻片(浸于酒精中用前过火灭菌),染色后取出盖玻片细胞面朝下放玻片上观察。 指示细胞:Vero(ATCC CCL-81或CCRC60013)或3T6(ATCC CCL-96或CCRC60070),细胞须先测试无污染。MEM,10%FBS(Vero的培养液)。 试剂准备:

  无菌HBSS:配置Hank's balanced salt solution,用0.22um无菌滤膜过滤除菌。 Hoechst 33258 储存液(100x):称取5.0mg二苯并噻唑和10.0毫克thimersol溶于100ml无菌HBSS,置于棕色瓶中,室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后,以1ml/支分装到1.5ml小离心管中,-20℃保存。 Hoechst 33258 工作液:取1ml储存液加入100ml无菌HBSS中,室温下搅拌45分钟,置于棕色瓶中并以锡箔纸包裹,避广光保存于4℃。 封固溶液(mounting solution):22.2ml0.2M 柠檬酸和27.8ml0.2M Na2HPO4加入50ml甘油中,用1N NaOH调pH至5.5(pH很重要),4℃保存。 固定液:冰醋酸:甲醇=1:3(v:v),用前配置。 步骤:

  培养Vero细胞:Vero细胞可作长期培养或制作多个冻存管,测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。 在接种待测样品前一日,将Vero细胞以1-2x104细胞/ml培养于chamber slide中,每孔加入1ml细胞悬浮液,于37℃,5%CO2培养。隔日确定生长良好后即可接种待测样品细胞。 接种待测样品:样品种类:1ml待测的培养基,1ml待测的细胞培养液(可刮下少许细胞)0.05-0.1ml 冷冻管的细胞悬浮液。 将待测样品加入chamber slide内培养5天后,进行Hoechst 33258的荧光染色观察。 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206感染Vero细胞作阳性对照,阴性对照用Vero细胞的新鲜培养基(MEM +10%FBS)。 DNA荧光染色检测:

  取出培养5天的Vero细胞,吸除培养液。每孔加2ml固定液,静置十分钟后吸除固定液,重复一次,风干10分钟。 每孔加入1mlHoechst 33258 工作液,室温下静置30分钟。 吸掉Hoeshst 33258染液后,用无菌水洗涤3次,风干后加入1滴封固溶液,并以盖玻片盖之。 用100-400x荧光显微镜观察。打开汞灯10分钟后,用UV激发光(330-380nm)的滤光镜,观察细胞核外是否有兰色荧光小点或丝状点的荧光。 结果判断:如有支原体污染,在Vero细胞核外与细胞表面会出现兰色荧光小点或丝状点。其形状一致,与细胞残片染成的不规则点状物不同。其荧光可维持数周。(见上图)

  本文内容主要来自台湾国家卫生研究院细胞库

  PCR法测细胞培养的支原体污染

  原理:利用特殊专一性的引物,经PCR反应来复制支原体DNA。所用的引物来自支原体的保守16S-23S的rRNA序列,由于这段spacer的序列随支原体种类不同而不同,因此可依所复制的DNA大小及其特异性片段的大小来作检测及鉴定。

  特点:灵敏及快速,可检测到不易培养的支原体,不必培养支原体作阴阳性对照,避免可能带来的污染。缺点:PCR反应很灵敏,容易带来假阳性结果,仅能作为参考。

  材料与设备:ATCC支原体检测试剂盒(可作50-100个反应,提供第一阶段引物混合物与第二阶段引物混合物,有DNA阳性对照(A. laidlawii, M. pirum)),PCR反应试剂(Taq聚合酶,dNTP,10xPCRbuffer,25mM 氯化镁,PCR水),PCR仪,琼脂糖胶电泳设备,手套,无菌PCR反应管,无菌1.5ml微量离心管,无菌2ul、20ul、200ul、1000ul枪头。

  引物序列:

  第一阶段引物混合物:1. ACACCATGGGAG(C/T)TGGTAAT,2. CTTC(A/T)TCGACTT(C/T)CAGACCCAAGGCAT,3. AAAGTGGGCAATACCCACGC,4. TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG 第二阶段引物混合物:1. GTG(C/G)GG(A/C)TGGATCACCTCCT,2. GCATCCACCA(A/T)A(A/T)AC(C/T)CTT,3. CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT 操作过程:

  第一阶段的PCR反应:加样品2ul(直接取待测细胞培养液、支原体DNA(+)、PCR水(-)),10x buffer(含1.5mM氯化镁)2.5ul,第一阶段引物混合物0.5ul,dNTP(1.25mM each)1.0ul,氯化镁(25mM)0.5ul,Taq DNA 聚合酶(5U/ul)0.1ul,PCR水18.4ul至PCR管,混匀,放入PCR仪反应。 PCR反应(第一阶段与第二阶段同):94℃变性(30秒),94℃(30秒)、55℃(2分钟)、72℃(2分)30循环,72℃延伸(5分钟),4℃保存 第二阶段PCR反应:加样品1ul(第一阶段产物),10x buffer(含1.5mM氯化镁)2.5ul,第一阶段引物混合物0.5ul,dNTP(1.25mM each)1.0ul,氯化镁(25mM)0.5ul,Taq DNA 聚合酶(5U/ul)0.1ul,PCR水19.4ul至PCR管,混匀,放入PCR仪反应,反应程序同2。 琼脂糖凝胶电泳:2.0%琼脂糖凝胶(含EB),1xTAE电泳缓冲液,选择100-500bp DNA marker,第二阶段反应产物各取10ul加入2ul loading dye(6x),电泳分离(100V,25分钟),紫外灯下观察并照相记录。 结果判断:不同种支原体第二阶段PCR得到的片段大小为: M. arginini 236bp, M. fermentas 365bp, M. hominis 236bp, M. hyorhinis 315bp, M.oral 290bp,M. pirum 323bp, M. salivarium 269bp, M. laidlawii 426bp+219bp

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