生物芯片(DNA微阵列)荧光扫描仪中的激光共聚焦扫描技术

http://www.microimage.com.cnMiffy(2010-11-30 16:37:11)

  所有的微阵列上的荧光须经荧光扫描装置来分析其上的荧光强度和分布,在这些装置中,激光共聚焦扫描仪具有优越的性能,能获取高质量的图像和数据,本文将分别介绍微阵列的相关特性和各种类型的微阵列扫描仪,激光共聚焦扫描仪的设计和关键特性,另外还将介绍一种已商品化的激光共聚焦荧光扫描装置。

  微阵列是由分子整齐排列于固相表面,这些分子与荧光分子结合,测定荧光分子的强度后可推知结合分子的浓度。固相部分主要有经过表面化学处理的玻璃片如22mmχ75mm的载玻片。在微阵列上包被的分子常常能与多种荧光探针通过化学键相互作用而联结,通常情况下能联结两种荧光分子,例如在检测不同样品的基因表达的区别时,可将其中一样品(如正常组织)标记上发绿光的荧光分子,将另一种样品如肿瘤组织或发病组织标记上另一种发红光的荧光分子,用两种波长的激光激发微阵列上的样品,通过比较两种荧光在微阵列上某点的比例得知某类基因在两种组织中的差异。

  微阵列上有样品组成的点阵,除了点之外,余下的是背景。如果玻璃片未经过表面化学处理,样品在玻片上结合不牢固,且容易扩散,造成背景高。若玻璃片经过表面化学处理后,点样的样品在微阵列上结合牢固,点的直径小,不扩散,从而点的密度增加,在进行荧光数据分析时,仪器将点上的荧光强度与点周围的背景强度相比较,如果背景中含有与荧光波段相一致的物质,则背景强度增高,样品的荧光信号将减弱,干扰信号的读取。

  点阵上的点直径范围为25mm-500mm,通常目前能达到的直径为100mm±50,科学家们正在努力减小直径。因为点直径的变化对扫描结果的读取产生影响,如果点的直径大,荧光分子扩散的范围也大,则观察到的荧光强度相对较弱。

  若在玻片上有灰尘或其它杂质如衣物纤维、皮屑、指纹等,扫描结果将受到影响。微阵列上的点干燥后形成很薄的层,使得激光共聚焦扫描成为可能,精心地调整扫描仪的焦距,可避免检测出不需要的背景杂质,包括微阵列上的灰尘、玻璃中自带的荧光杂质产生的干扰信号均可通过激光共聚焦的方式将其减少到最低程度。因为杂交因素影响,在微阵列上点与点之间的荧光强度差别很大。对微阵列扫描仪的要求要能够有较宽范围的灵敏度,通常来说,灵敏度调整范围为10000:1。

  当荧光化合物或染料受到激光激发后将释放出荧光,在某一波长下有一最高释放强度。各种荧光化合物有各自特定的激发吸收值。如图1是FITC的波长对荧光激发强度曲线。从曲线图可见,在494纳米波长下,有一激发高峰,在518纳米下有一释放高峰,释放与激发高峰波长相差24纳米,这一现象在微阵列使用的染料中较普遍。两高峰波长的差值在专业上称之为Strokes shift, 初看曲线图人们可能会以为:FITC在510纳米的波长激发下,在475-510纳米范围内将释放部分荧光,其实并不尽然;释放波长一般情况下大于激发波长,在图中的激发曲线不是与释放曲线同时绘制的,将它们放在同一坐标图中是为了便于观看,其实它们是两套不同的数据。激发曲线的绘制过程如下:在单一长波长下,变换激发波长在不同波长下测定荧光释放强度,释放荧光曲线的绘制过程则是在最长激发波长下开始增加波长,测定在不同波长下的荧光释放强度。微阵列扫描仪设计者通过阅读和分析某中荧光染料的激发曲线和释放曲线来确定适合某种染料的复合扫描激发波长,该波长的激发效率至少要达到50-70%的水平。激发波长要避免太接近释放高峰对应的波长,否则荧光信号受到干扰。所以应在峰值的左边选择一激发波长。如对FITC来说,建议的激发波长在470-495nm.荧光释放强度在某一范围内,与激发光的强度成正比,当荧光释放达到最高峰后,增加激发光强度却不能提高释放强度,因为荧光释放已经达到饱和或光子将染料破坏淬灭。微阵列上各点的荧光分子受到激发后,从各个方向释放荧光光子,散射成球状,所以扫描仪须将这些散射的光子采集到,由于扫描仪的使用的是很低的释放光,几何球状是设计扫描设备的主要根据。

  图1 FITC的波长对荧光激发强度曲线

  微阵列扫描仪可有多种设计类型,但任何类型的微阵列扫描仪都有以下基本功能:

  激发光

  激发光的产生源有多种,如激光、氩灯、LEDs或钨丝灯。激发光的波长要避免将释放光的波长覆盖或重叠。对于LEDs或钨丝灯需用滤光器来选择某种特定波长的光。激光的波长单一不需要滤光器来选择某种特定波长的光。灯泡光源可产生多个波长的激发光,通过多个滤光器可选择多种特定的波长以满足激发不同荧光的需要。激发光应直接射向微阵列上的待测样品,通过大量一次照明的方式,待测样品的大部分区域同时受到激发,这种方式在CCD数码相机中较常见,该方式的缺陷是待测样品的受到得激发光不够均匀一致。这点是仪器设计者须考虑到的重要因数之一。另一种方式是:激发光聚焦于样品的很小部分,采用特定的光线采集和定位,聚焦点上的激发光光线密度较高,大约为10000watt/cm2。激发波长的选择是依据染料的激发曲线和释放曲线的峰值来确定的,在染料激发峰值的左边且激发效率较高的范围内,在某种染料水平下,激发效率越低,要达到某种光强,则需要向样品上发射的光越多。过多的发射光将通过光漂白作用破坏样品和污染干扰释放光的信号。

  释放光采集

  荧光由目镜的镜头来采集,该镜头聚焦于样品上并将一定区域内的光线收集到装置。收集的角度区域的大小非常关键,荧光释放是球形的,目镜对荧光的采集范围是决定仪器的采集效率关键指标之一。目镜采集光的角度由数值孔径来表示,图2表示了数值孔径与光采集效率之间的变化关系。当数值孔径为1.0时,目镜将收集到整个半球的光,相应的光采集效率为50%。在许多激光共聚焦微阵列扫描仪的数值孔径在 0.5-0.9, 而CCD-扫描仪的数值孔径为0.2-0.5。有其他类型的扫描仪不用目镜而是使用积分球面镜来采集释放的部分光源,但是部分光线经过多次球面反射而衰减。还有一些无散光收集装置,仅仅是将探测器放在样品的某一区域的上方,光线采集的效率受限于样品被照明处的范围及探测器的视角,例如,一个直径为25mm的探测器放在激发点上方100mm处,其实际的有效数值孔径为0.12。图2显示目镜的不同数值孔径与光采集效率的关系。

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