免疫组化SP法步骤

http://www.microimage.com.cncyh(2010-11-23 16:33:59)

  SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.按标记物质的种类,如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等,可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法);按结合方式可分为抗原—抗体结合,如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法和亲和连接,如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法等,其中SP法是最常使用的方法。

  一般的sp法步骤啊,具体如下:1.烤片,68℃,20分钟,

  2. 常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水;二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min

  3.阻断灭活内源性过氧化物酶:3%H2O2 37℃孵育10min,PBS冲洗3X5min;4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷却20min 以上,再用冷水冲洗缸子,加快冷却至室温,PBS冲洗3X5min。5. 正常羊血清工作液封闭,37℃10 min,倾去勿洗.

  6. 滴加一抗4℃冰箱孵育过夜,PBS冲洗3X5min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照);

  滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;

  7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;

  8. DAB/ H2O2反应染色,自来水充分冲洗后,

  苏木素复染,常规脱水,透明,干燥,封片。

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