Methods:荧光成像技术(二)

http://www.microimage.com.cncyh(2010-11-17 13:47:16)

  体内荧光成像主要由灵敏的CCD及其分析软件和作为报告子的荧光素酶(luciferase)以及荧光素(luciferin)组成,可以直接对活体生物体内的细胞活动和基因行为进行监控,适合于观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。这种方法可以对同一组实验对象在不同时间点进行记录,跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)的移动及变化,因此比较于传统的动物实验方法,所得的数据更加真实可信。

  尽管这种技术具有操作简单,结果直观,灵敏度高等优点,但是仍然也存在许多问题,比如在成像过程中,有些细胞会发出其自身的荧光,扰乱研究人员使用的绿色荧光蛋白发出的光。

  为了排除这种干扰,一些研究人员采用了双色双标记的方法,比如今年英国爱丁堡大学爱丁堡癌症研究中心的研究人员就发明了一种新型双色的光激活荧光蛋白,这种融合蛋白融合了红色荧光蛋白(RFP)单体Cherry和GFP的光激活变异体。这种融合蛋白能够在表达标志物的细胞中持续发出红色荧光,而绿色荧光只有在405-nm光激发下才会发出。

  一些厂家也推出了相应的细胞示踪产品,来自于荧光产品集大成者:Molecular Probes(被Invitrogen收购)的Cell Tracker系列产品(包括Cell Tracker Orange,Cell Tracker Blue,Cell Tracker Green,Cell Tracker Red等,最大激发波长不同)就是一类经典的荧光示踪染料。

  其中Cell Tracker Orange就是一种应用广泛的细胞示踪染料,这种“vital dye”能浸入活细胞的细胞膜,结合到只有这种T细胞才表达的一种蛋白上,便于从组织自发荧光区分开来。作为良好的细胞形态学示踪产品,荧光探针或检测分子需具有定位于细胞或细胞器的能力、并在这些结构中长期存在。对于活细胞和组织来说,示踪剂还必须是无生物活性及无毒的。这些条件都满足的情况下,示踪剂才能发挥作用。研究人员可以利用双光子显微技术(2-photon microscopy),从而捕获不同颜色的信号,其中一种染料可以作为了一种阳性背景。

  Cell Tracker系列产品包含有氯甲基基团,体外实验显示参与GST反应,能与硫醇相互作用,在大多数细胞中,谷胱甘肽的表达水平都比较高,并且谷胱甘肽转移酶也随处可见,因此这种染料添加到细胞培养物中,经过洗涤进入细胞,能在细胞中能存留多代,并不会转移到该群的其他细胞中去(仅有很小可能会通过缝隙连接转移)。这种探针在荧光染料的细胞存留能力上实现了一个突破,用于移植细胞和组织的长时间示踪非常理想。

  另外一些成形的系统也可以通过不同波长的激发光来减少自发荧光的影响,比如颇为出名的Xenogen的IVIS系统就可以检测波长范围400-950nm的荧光,通过六块不同的激发光滤镜获得所需的特定激发光波长。光线通过第二块蓝色漂移背景光滤镜(blue-shifted background filters),使得初始的激发光产生轻微的蓝色漂移。以不同波长的激发光,在不激发荧光报告基团时激发组织的自发荧光,从而将靶信号与背景光区分开,消除自发荧光 。

  LI-COR公司推出的Odyssey双色红外荧光成像系统利用其专利的红外染料技术,两个独立的红外荧光通道检测荧光信号。该系统具有685nm和785nm激发波长的两个独立的红外激光器,分别激发两种红外荧光染料,产生720nm和820nm的发射光,然后由两个高灵敏度雪崩式光电二极管检测器同时检测荧光信号。

  一般的荧光染料不能有效地用于检测膜上的蛋白或者塑料培养皿中的蛋白,因为它们的激发和检测波长位于可见光谱区,易形成膜(NC膜、PVDF膜、尼龙膜)的高背景荧光干扰。而在红外波长区检测荧光信号,具有背景低,信噪比高的特点。因此,Odyssey可以用于检测膜上和微孔板上的蛋白或核酸,并对其进行精确的定量分析。

  而Pearl Imager活体成像系统则是通过其独特的近红外荧光优势减少了自发荧光的影响。光的吸收和散射很大程度上取决于激发光源,通常由于生物活体内的很多物质,譬如血红素,黑色素以及脂质对于激发光具有一定的吸收度,而这种吸收度是随着激发荧光波长的不同而变化的,波长越长,活体对于光的吸收和散射程度越低。而在大于900nm波长的红外光下,吸水性又会导致高的背景噪音。Pearl Imager采用的近红外荧光则取巧的选择了近红外这个波长范围,在这个区域,活体内物质自发荧光对于成像干扰小,背景噪音也不大,因此可以说近红外荧光染料基团是比较理想的动物活体成像标记物质。

  Pearl Imager就是利用了这些报告基因,比如IRDye 800CW, Cy7, and Alexa Fluor 750,再配上灵敏的CCD光学检测仪器,从而成就了这样一种灵敏高效的荧光成像系统。

  除此之外,在体内荧光成像过程中,如果确实遇到了无法逾越的问题,也可以考虑转向其它方法,比如更换光源,GE公司基于时域技术的eXplore Optix成像系统,利用的就是脉冲激光二极管发送窄光谱的激光短脉,这种方法突破了传统成像方法对光学信号强度的依赖,能提供对荧光团强度、浓度和三维定位的精确测量,并且由于eXplore Optix具有纳秒级的时间分辨率,所以研究人员可进行活体荧光寿命测量,从而辨别具有类似光谱图的荧光团。除此之外,由于eXplore Optix是集成的多模式平台,因此可以对多个生物学靶标进行分析监控。

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