微生物分子生物学技术及其在环境污染研究中的应用

http://www.microimage.com.cnAndy(2010-11-05 11:34:37)

  摘要:本文较为系统地概述了核酸探针检测技术、利用引物的PCR技术、DNA序列分析技术和电泳分离及显示技术的研究进展,并探讨了这些技术在环境污染研究中的应用及其方向,表明,这些被认为是重要的微生物分子技术,在探索微生物与污染环境之间的相互关系中发挥了重要作用,推进了污染环境微生物研究的发展。

      关键词:微生物 分子生物学 环境污染

  在新世纪之初,由于全球人增地减、资源匮乏,人类对环境的依赖性愈来愈强烈。随着人类的生活要求和工农业生产的迅速发展,大量人工合成的并难以被天然微生物迅速降解转化的污染性化合物进入到自然环境中,成为严重威胁人类及其他生物正常生存发展的土壤污染区,污染还导致资源环境中生物重组,使物种的分布与多度均发生深刻的变化,致使系统变得越来越脆弱,降低了生态系统的功能稳定性。因此,治理破坏环境生态的各种污染,已成为世界各国普遍关注并努力攻克的热点问题。最近20年间,以核酸技术为主要内容的分子生物学技术的广泛应用,在揭示生物多样性的研究中提供了新的方法论,开拓了分子生物学与生态学交叉领域。通过检测生物自然种群DNA序列多态性,鉴定个体的基因型,在基因水平评价种群遗传分化,并在分子水平阐述分子适应等生态问题的机制,更好地揭示生物与环境之间的生态学意义,为污染环境的生物修复提供理论依据。

1. 微生物分子生态学技术

1.1 核酸探针检测技术

   以核酸分子杂交技术为核心,利用探针分析DNA序列及片段长度多态性*探针是能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核酸片段,它可以是长探针(100~1000bp),也可以是短核苷酸片段(10~50bp),可以是从RNA制备cDNA探针,也可以是PCR产物或人工合成的寡核苷酸探针。根据碱基互补配对的原则,被标记(放射性或非放射性的)的核苷酸探针以原位杂交、Southern(印迹杂交、斑点印迹和狭线印迹杂交等不同的方法,可直接用来探测溶液中、细胞组织内或固定在膜上的同源核酸序列)由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性,使得核酸分子杂交技术广泛应用于对环境中的生物的检测,定性、定量分析它们的存在、分布、丰度和适应性等研究目标。

   基因探针方法学利用了DNA能变性和重退火的特性。要做一个基因探针,所研究的这个基因的DNA顺序必须清楚。这个基因对一特定的微生物种可能是独特的,在这种情况下,这一DNA顺序就有利于检出那种微生物体。或者,这个基因可能编码一种某一代谢途径独特的酶,从这样一种序列构建出的基因探针就有可能指示土壤或水样品中一群细菌的潜在活性。这类探针可定义为功能性基因探针。例如,由编码固氮作用的酶的DNA序列可做成基因探针,这样的探针就可以用于测估特定的土壤中是否含有携带固氮基因的细菌。随后,还可以构建另外的探针,用以测定这些机体实际上是根瘤菌属或固氮螺菌属的一些种,或者是蓝细菌。这一基因甚至可能对所有的细菌来说是通用的,因而使检出所有已知细菌成为可能。

1.2 利用引物的PCR技术

   在分子生态学中,根据扩增的模板、引物序列来源及反应条件的不同可将PCR技术分为以下几种:1)反转录PCR技术(Rt-PCR),[next]是在mRNA反转录之后进行的PCR扩增,可以用来分析不同生长时期的mRNA表达状况的相关性)。2)竞争PCR(C-PCR),是一种定量PCR,通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度,对目的模板作定量研究。3)扩增的rDNA限制酶切分析技术(ARDRA),是美国最新发展起来的一项现代生物鉴定技术,它依据原核生物rDNA序列的保守性,将扩增的rDNA片段进行酶切,然后通过酶切图谱来分析菌间的多样性。4)随机扩增多态性DNA技术(RAPD),是以一个通常为10碱基的寡核苷酸序列为引物,对基因组DNA随机扩增来鉴别多态性DNA的过程,RAPD分析不需要生物DNA序列,而且DNA用量少,无种族特异性,不需要制备克隆、探针标记和分子杂交等,是一种易推广应用的技术。

1.3 DNA序列分析

   最充分揭示DNA多样性的方法是DNA序列分析)尤其是荧光标记的核酸自动测序仪的普遍使用,同时随着分子信息学的发展,已有许多功能基因及专门的’DNA序列数据库软件供序列比较,使核基因的序列分析可揭示更高水平多态性)生态学上用的最多的是“通用”引物扩增DNA某些基因(如DNA)的DNA片段,随后用通用引物直接测序)。

1.4 电泳分离及显示方法

   一般在核酸技术中,都会用到电泳分离方法:琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭染色方法;或聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的方法。相比之下,后者灵敏度高,每次电泳只要加1~3uL的PCR扩增产物,一次扩增可多次电泳,但操作要比琼脂糖凝胶电泳复杂得多。

1.5 生物芯片

   近年来,高通量的DNA序列筛选推动了生物芯片技术的发展。生物芯片是指一套DNA探针,通常是从cDNA或基因组克隆纯化的PCR产物,存放在固体支持物(一般用显微镜载玻片)上,其密度可达每平方厘米几百个点。芯片主要用于基因表达。这项技术已经在制药工业中用于查看药物反应。然而,这项技术的应用看来是无止境的。在环境微生物学中,生物芯片具有一次试验就可筛选饮用给水中几百病原体的潜在能力。

2. 分子生态学技术在环境污染研究中的应用

2.1 污染环境微生物种群动态的分析

   在微生物系统分析中,16SrRNANA的比率是检测复杂的微生物种群特定成员代谢活动的有效参数。核酸可以通过以专一性和通用型探针分别与直接从微生物样品中分离的总核苷酸进行杂交,可获得相对于总16SrRNA的特定16SrRNA数量,其相对丰度可以用与专一性探针和通用型探针杂交的残余放射性强度之比来表示。在稳定的条件下,某种微生物的RNANA比率是与它生长率呈正相关。利用定量点渍杂交求RNANA的比率时,具有很低丰度的rRNA序列也可以被定量,但由于不同种生物细胞内有不同数量的核糖体,甚至同一种细胞内在不同时期核糖体数目也不同,所以rRNA的丰度不能直接用于表示某类微生物细胞数的多少,但可以代表特定种群的相对生理活性,这对研究生态系统功能多样性有重要的意义。

2.2 污染环境微生物适应性———质粒的分子生态效应[next]  在污染环境中,微生物通过调节其结构和生理状况,或者形成能在自然环境中广泛传播的质粒,完善那些降解异生物质酶系的遗传基因,以适应日益污染的环境!这种对环境的遗传适应是进化的机制!探索自然种群对环境的调整与适应的遗传基础,特别是微生物对环境污染物的反应,是近代微生物生态学和分子生态学共同关注的焦点!许多研究表明,细菌对环境中的特异性限制因子的应答能力一般是由质粒控制的!质粒在为宿主细胞提供遗传多样性及其利用大范围生态位的适应中起着非常重要的作用。因此,对降解性质粒特征及其在环境污染物净化或解毒过程的分子生态学进行研究,具有实践上的重要意义。

   质粒为细胞质中进行复制的自主复制子,是染色体外的遗传物质,核酸技术在分子生态学中的应用成为质粒研究的新动力。质粒的产生不仅会引起种的多样性,更主要的是它有足够的灵活遗传力去发展它们重组质粒所携带的代谢基因,表现不同的生态功能,因此,质粒的基因很自然地成为污染环境的微生物分子生态学研究的对象!近年来,已经发现了许多降解脂肪烃、芳香烃、多环芳烃以及它们的氧化产物、萜烯、生物碱、氯代芳烃和多氯联苯的质粒基因,其中大多来自假单胞菌属等:微生物分子生态学技术及其在环境污染研究中的应用假单胞菌属、脱氮产碱杆菌或富营养产碱杆菌、红球菌的菌株,还有分支杆菌属的多个种。

3.结语

   从污染环境微生物分子生态学的研究进程可见,分子生态学技术的应用不仅扩大了环境微生物的研究对象,促进了微生物结构生态学研究,更重大的突破是有助于更深入、更多地了解生态学过程,使得以功能基因为基础的功能生态学研究成为今后污染生态学领域的新方向$特别对污染胁迫下的微生物,研究功能基因在环境中的表达调控,可更真实、准确地揭示微生物的生态关系,明确生态系统的结构与功能,即生态系统中一系列基因的相互作用。

   在自然界中存在大量可挖掘和利用的具有抗逆性、高降解能力等优异基因的微生物资源,但通过传统的方法却不能分离甚至检测,在分子生态学研究领域可以克服技术上的障碍,检测更多的微生物种群,并可在分子水平对其生态功能进行分析、操作$目前,很多氯代有机物、多氯联苯、萘、菲、蒽、芘、菊酯类等污染物的部分降解基因已被克隆并已阐明其序列结构和功能,在此基础上,可进一步探索自然种群对环境的调整与适应的遗传基础,从功能上阐明分子适应及生态学过程的分子机理,进一步通过基因工程操作将某些不同生物体中控制有用的生物降解途径或酶的微生物异化代谢基因带到同一寄主中,按照设计的生物代谢途径运行,以实现对环境污染物或特定毒物的降解,从而显著地或彻底地改善微生物在污染环境修复中的功能。
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