大鼠胃促黄体生成素及其受体的免疫组化及原位杂交研究

http://www.microimage.com.cnAndy(2010-10-15 14:06:48)

  0引言

  LH(luteinizing hormone, LH)及其受体(luteinizing hormone receptor, LHR)可以在下丘脑-垂体-性腺轴之外表达已经被公认. 我们先前的实验已经证明,大鼠颌下腺的浆液性腺泡上皮细胞能够表达LH及其受体[1-2],但作为消化系统最重要器官之一的胃组织是否表达LH及其受体,目前尚未阐明,本实验采用免疫组织化学和原位杂交等技术对该问题进行了研究.

  1材料和方法

  1.1材料正常雄性SD大鼠,体质量(200±20)g,购自第四军医大学试验动物中心;LH mAb购自美国ZYMED公司;LHR多克隆抗体、SABC试剂盒与敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ型为武汉BOSTER公司产品; pMD 18T Vector 购自TaKaRa公司;地高辛标记随机引物标记试剂盒购自Roche; Hind Ⅲ,EcoRⅠ内切酶购自New England Biolabs公司;胶回收试剂盒购自Promega公司;DAB显色试剂盒购自北京中山试剂公司.

  1.2方法

  1.2.1LH及其受体的免疫组织化学SABC法SD大鼠术前晚禁食不禁水,经腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉,取出胃组织立即放入Bouins液中固定,用石蜡包埋后将组织蜡块切成4 mm的切片,并将切片贴附于APES处理过的载玻片上,烘干备用. 将切片进行二甲苯脱蜡,先后各10 min,无水乙醇5 min,加入30 g/L甲醇H2O2中20 min以去除内源性过氧化物酶,然后按SABC法进行LH及其受体的免疫组织化学染色,第一抗体:LH抗体(1∶500稀释)和LHR抗体(1∶300稀释),在4℃冰箱孵育过夜,第二抗体: LH和LHR分别为生物素标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG(1∶200稀释),室温孵育2 h. SABC复合物(1∶200稀释)室温孵育30 min. DAB显色10~15 min,蒸馏水终止反应,剃度乙醇脱水,透明二甲苯两次,各10 min,中性树胶封片. 用正常兔血清取代第一抗体进行孵育作阴性对照.

  1.2.2LH及其受体的标记探针根据文献[2]产生的克隆制备探针,分别从LH及其受体的pMD 18Tvector上 切下最初的DNA片段,长度分别为150,650 bp,并进行回收,采用随即引物标记法进行标记,具体方法按Roche公司的地高辛标记试剂盒进行:用灭菌去离子蒸馏水稀释1 μg DNA至总体积16 μL;把DNA瓶置于沸水中,水浴10 min. 然后,迅速冰浴3 min以上,使DNA热变性;加4 μL DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再1000 g离心5 min,置37℃水浴反应过夜,时间越长,产量越高. 延长反应时间至20 h可明显增加地高辛标记DNA的产量,并加入0.2 mmol/L EDTA 2 μL以终止反应,置-20℃保存备用.

  1.2.3LH及LHR mRNA原位杂交程序用上述方法麻醉动物后,取出胃组织立即放入用Bouins液(内含1g/L DEPC)中固定,整个制片过程均防RNA酶污染,切片厚度为4 μm,将切片进行二甲苯脱蜡,先后各15 min,剃度乙醇水化,加入30 g/L甲醇H2O2中20 min以去除内源性过氧化物酶;胃蛋白酶活性37℃消化30 s,以增加探针的穿透力;4 g/L多聚甲醛终止反应5 min,以终止蛋白酶K的作用;每张切片滴加含2.0 mg/L地高辛标记探针的原位杂交液30 μl,置湿盒中42℃杂交20 h;分别用37℃预热的2×SSC,0.1×SSC洗涤5 min×3,10 min×2;滴加小鼠抗地高辛抗体37℃,2 h,0.5 mol/L TBS洗涤5 min×3;滴加生物素化羊抗小鼠IgG 37℃ 1 h,0.5 mol/L TBS洗涤5 min×3;滴加ABC 37℃ 30 min. 最后用 DAB显色液显色,室温10~15 min,镜下观察其显色情况,水洗终止反应. 梯度乙醇脱水,中性树胶封片. 阴性对照分别用不含探针的杂交缓冲液取代含探针的杂交液,及用正常羊血清取代羊抗地高辛抗体IgG进行孵育.

  2结果

  2.1LH及LHR免疫组织化学结果LH及LHR免疫反应阳性细胞呈棕黄色,背底不着色,反差明显,阳性细胞很易鉴别,两种阴性对照实验均呈阴性反应. 大鼠胃小凹上皮细胞呈LH与LHR免疫反应阴性,而在胃底腺壁细胞、主细胞均呈阳性反应,阳性物质分布于细胞质,细胞核呈阴性分布,但粘液细胞均呈阴性反应(图1).

  2.2LH及LHR mRNA原位杂交LH及LHR mRNA杂交信号的细胞也呈棕黄色,背底不着色,反差明显,阳性细胞很易辨认,阴性对照试验呈阴性反应. 在大鼠胃LH及LHR mRNA杂交信号分布一致,阳性信号物质主要位于胃底腺壁细胞、主细胞的细胞质内,细胞核呈阴性,但粘液细胞内的杂交信号均呈阴性反应(图2).

  胃壁细胞(↑)和主细胞(*)呈LH免疫反应阳性,阳性物质分布于细胞质,细胞核呈阴性分布.

  图1大鼠胃底腺LH免疫组织化学染色SABC ×200(略)

  阳性物质位于胃壁细胞(↑)和主细胞(*)的细胞质内,胞核呈阴性.

  图2大鼠底腺LH mRNA杂交信号DAB ×400(略)

  3讨论

  传统认为LH和绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin, CG)分别是由腺垂体嗜碱性细胞、胎盘滋养细胞所分泌的糖蛋白,二者具有相似的立体结构,并与表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)等属于同一个超家族,因此LH和CG除了传统的内分泌作用外,它们也具有生长因子的特性. 近年来的许多研究表明,LH及其受体可存在于脑垂体之外,如前列腺[3]、卵巢[4]、睾丸[5]及颌下腺[2]等组织,这说明LH也可能异位合成并通过旁分泌或自分泌效应调节不同类型细胞的功能. 这与本实验的研究结果是相一致的.

  胃壁细胞是一种多功能的细胞,既能分泌多种生物活性物质,又有多种生物活性物质的受体的表达[6]. 我们先前的研究已经发现,胃壁细胞既能表达GnRH又能表达GnRH受体[7],并且GnRH类似物对胃酸的分泌起一定的抑制作用. 我们近来的研究也发现[8],胃壁细胞的促卵泡激素(folliclestimulating hormone, FSH)受体免疫反应呈阳性,并认为FSH 对大鼠胃底腺壁细胞的功能可能有一定的调节作用. 本研究发现,大鼠胃壁细胞LH及LH受体免疫反应呈阳性,提示该处可能存在GnRHLH的调节轴,对胃壁细胞功能进行调节,但是它究竟起哪种功能起调节作用有待进一步研究加以证实.

  胃主细胞是胃底腺中数量最多的细胞,其最主要的功能是分泌胃蛋白酶原. 近年来的研究表明,胃主细胞也是一种功能较多的细胞,如在主细胞上可表达转化生长因子(transforming growth factor, TGF)和EGF受体,主细胞可以通过邻近壁细胞的旁分泌作用产生的EGF来调节壁细胞的[9]数量,还可以通过EFG来调节胃脂肪酶的活性,其作用途径可能是通过有丝分裂蛋白激酶p42/44来实现的[10]. 本研究中发现,胃主细胞LH及LH受体均呈免疫反应阳性,因此推测LH可能对主细胞的功能进行调节,其作用途径也可能是通过邻近壁细胞的旁分泌作用,或是通过自分泌效应来调节细胞的生长及功能,但有待于进一步实验加以证实.

  【参考文献】
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