原位杂交检测BclxlmRNA在血管瘤组织中的表达及意义

http://www.microimage.com.cnAndy(2010-10-15 13:59:51)

  血管瘤是好发于婴幼儿的一种常见良性血管肿瘤。内皮细胞过度增生是血管瘤的特征性病理改变,也是血管瘤发生、发展及其演变的实质。根据血管瘤内皮细胞的生物学特点并结合临床,可将血管瘤的自然病程分为增生期、退化期和退化完成期。目前,血管瘤的发生、发展和退化机制尚未完全阐明。现有研究发现,内皮细胞增殖状态的改变、多种血管形成因子和血管形成抑制因子在血管瘤不同时期表达水平的变化以及内皮细胞增殖与凋亡的不平衡与血管瘤的发生、发展和退化有密切关系。目前的实验研究中,尤其引人关注的焦点之一是血管瘤自发消退的机制。Bclxl属于抑凋亡基因,是比较重要的癌基因,它与血管生成有一定关系。有关Bclxl基因蛋白在恶性肿瘤中的研究较多,而在血管瘤组织中的研究国内外尚未见报道。本课题应用原位杂交方法对增生期、退化期血管瘤和正常皮肤血管组织中BclxlmRNA的表达进行了检测,旨在探讨其与血管瘤发生、发展的关系及其分子机制。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 材料来源

  收集武汉大学人民医院病理科2002~2006年皮肤血管瘤存档蜡块40例,其中男性20例,女性20例。血管瘤所在的部位主要有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。

  1.1.2 材料分组

  蜡块切片厚5 μm,贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上,置于烤箱烤干待用。常规HE染色,按Mulliken分类标准并结合PCNA的表达进行分组:增生期血管瘤22例,退化期血管瘤18例,另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。

  2 方法

  2.1 常规HE染色
  取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。

  2.2 原位杂交检测BclxlmRNA的表达

  ① 组织切片常规脱蜡至水

  ② 3 %H2O2室温处理10min以灭活内源性过氧化物酶
  ③ 切片上滴加胰蛋白酶37℃消化25 min

  ④ 按每张切片加20 μl含生物素标记寡核苷酸探针的原位杂交液,37℃恒温过夜进行杂交

  ⑤ 洗脱后滴加封闭液37℃,20 min

  ⑥ 滴加SAHRP37℃处理20 min

  ⑦ DAB显色,脱水,透明,封片

  用PBS代替含寡核苷酸探针的原位杂交液作为阴性对照组,人扁桃体作为阳性对照组。

  2.3 免疫组织化学结果判断

  原位杂交细胞膜或胞浆呈蓝色为BclxlmRNA阳性,阴性对照组应无蓝色反应物。

  采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对BclxlmRNA的表达进行定量分析,每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400),测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

  2.4 统计学处理

  对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验,检验水准α为0.05。

  3 结果

  3.1 HE染色

  正常皮肤组织中的毛细血管由1到2个内皮细胞围成,管壁较薄,内皮细胞胞质薄,仅含核的部分略厚,内皮细胞核扁平。增生期血管瘤组织中可见内皮细胞增生呈团索状,内皮细胞核肥大而淡染;内皮细胞有的围成血管腔,有的不围成血管腔而呈团块状。退化期血管瘤组织中可见内皮细胞数量减少,内皮细胞核扁平;血管腔增大,血管间结缔组织增多。有时在同一个标本中,可以同时见到典型的增生期和退化期区域。

  3.2 原位杂交

  增生期血管瘤内皮细胞胞膜和胞浆有较密集蓝色颗粒;退化期血管瘤内皮细胞胞膜和胞浆蓝色颗粒不明显;正常皮肤组织血管内皮细胞胞膜和胞浆无蓝色颗粒沉积。图像分析及统计分析结果见表1。表1 血管瘤不同时期BclxlmRNA表达的平均光密度和阳性面积率(略)

  4 讨论

  细胞凋亡与肿瘤的关系是近年来的研究热点之一,细胞凋亡的失控是导致肿瘤发生发展的重要方面,其中Bcl2家族备受重视。Bcl2、BclxL和Bax是该家族中的重要成员,它们主要通过线粒体途径参与凋亡调控,当细胞受到死亡信号刺激,与Bcl2或BclxL蛋白相结合的Bax蛋白就会被置换出来,线粒体膜通透性增加,释放出一系列物质,最终导致细胞死亡[1] 。

  大量的研究表明,肿瘤的发生发展与细胞增殖、凋亡的动态平衡受破坏有关。Bcl2家族蛋白是重要的细胞凋亡调节因子,它们中有些抑制细胞凋亡(如Bcl2、Bclxl) ,有些则促进凋亡(如Bax、Bak)[2] ,其表达的改变不仅影响DNA损伤或周期异常细胞的正常凋亡,还影响肿瘤细胞自身的凋亡。大多数抗癌药物也是通过诱导肿瘤细胞的凋亡来发挥细胞毒作用。Bclxl是1993年Boise[3~5]以鼠Bcl2的cDNA为探针从鸡淋巴细胞cDNA文库中筛选到的一个克隆。Bclxl基因在mRNA水平存在两种拼接方式,即表达长片段的Bclxl及短片段的Bclxs,前者含241个氨基酸,有43%的序列与Bcl2相同,且功能相似,具有抗凋亡作用,但可通过不依赖于Bcl2的方式抑制凋亡,抑制多种凋亡诱导因素介导的细胞凋亡,处于凋亡调控的终末部分。Bclxl蛋白在部分Bcl2低表达的肿瘤,如胃癌和结肠癌中高表达。有人认为[6~8]Bclxl蛋白在部分肿瘤中可能接替了Bcl2的功能,在一定条件下,该蛋白显示比Bcl2更强的抑制凋亡作用,提示其在细胞转化的过程中发挥了关键性作用。

  我们过去利用免疫组织化学的方法检测了不同时期的血管瘤和正常皮肤血管组织中Bclxl的表达,结果证明增生期血管瘤Bclxl表达水平高于退化期,差异有显著性(P<0.01),增生期血管瘤Bclxl表达水平高于正常皮肤组织(P<0.05),说明Bclxl的高表达与血管瘤的发生有关。我们此次采用原位杂交的方法检测了同一批标本,利用含生物素标记寡核苷酸探针的原位杂交具有特异性强、敏感性高、定位精确、定量可靠,可完整的保持组织细胞的形态结构,能准确地反映组织细胞的相互关系及功能代谢状态的特点,探讨Bclxl与血管瘤病程的关系。结果与免疫组织化学相同, 增生期血管瘤BclxlmRNA表达水平高于退化期(P<0.01),增生期血管瘤BclxlmRNA表达水平高于正常皮肤组织(P<0.05),差异有显著性。Bclxl在增生期血管瘤内皮细胞呈高表达,是由于Bclxl是抑凋亡基因,Bclxl使血管瘤内皮细胞凋亡相对受到抑制,打破了增殖和凋亡的相对平衡, 血管瘤内皮细胞在体内无限增殖,使血管瘤内皮细胞有在体内不断增加,导致血管瘤组织不断增殖。这提示Bclxl蛋白在血管瘤的发生、发展过程中可能起到较重要的作用。

  【参考文献】
   1 Paradiso A, Simone G, LenaMD, et al. Expression of apoptosisrelated markers and clinical outcome in patients with advanced colorectal cancer. Br J Cancer, 2001, 84: 651~658.

  2 YangWL, Addona T, NairDG, et al. Apoptosis induced by cryoinjury in human colorectal cancer cells is associated with mitochondrial dysfunction. Int J Cancer, 2003, 103: 360~369.

  3 Bcl2 decreases the free Ca2+ concentration within the endoplasmic reticulum. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(11): 5723~5728.

  4 Harris MH, Thompson CB. The role of the Bcl2 family in the regulation of outer mitochondrial membrane permeability. Cell Death Differ, 2000, 7(12): 1182~1191.

  5 Pinton P, Ferrari D, Rapizzi E, et al. The Ca2+ concentration of the endoplasmic reticulum is a key determinant of ceramideinduced apoptosis: significance for the molecular mechanism of Bcl2 action. EMBO J, 2001, 20(11): 2690~2701.

  6 Boise LH, Gonzalez GM, Postema CE, et al. Bclx, a bcl2 related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell, 2001,74: 597~608.

  7 Walchshofer S, Jurecka W, Wolff K, et al. Immunohistochemical properties of bone marrow mast cells in systemic mastocytosis: evidence for expression of CD2, CD117 /Kit, and bclx l . HumPathol , 2001, 32: 545~552.

  8 Turner HE, Nagy Z, Gatter KC, et al. Proliferation, bcl2 expression and angiogenesis in pituitary adenoma: relationship to tumor behavior. Br J Cancer, 2000, 82(8): 1441~1445.

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