显微图像分析处理程序与方法

http://www.microimage.com.cnMiffy(2010-10-12 16:33:13)

  使用显微图像分析系统处理显微图像时,使用者实际操作很少,几乎完全是通过鼠标来操纵复杂的运行过程,计算机软件可按实际需要行使其功能。计算机屏幕上显示多项指令,由鼠标指明你所需要的程序即可。虽然不同品牌和不同型号的显微图像分析系统的具体性能参数不同,但在使用中基本处理过程相同.区别只在于对显微图像的不同采集参数和处理软件的设定和使用上。显微图像处理的基本过程包括制作切片样品、获取图像、图像分割、目标测量、统计分析和结果输出。 

 
  一、制作切片样品
  显微图像分析系统所用的切片与常规组织学切片的制作方法及要求基本相同,可根据研究者的目的选择适当类型切片。


  二、获取图像
  通过显微镜将切片图像放大,成像在摄像机上,完成光/电转换,再经模/数转换为数字信号输入计算机。在计算机屏幕上显示的数字化显微图像由于各种原因(如:图像采集卡的性能、显微镜及光源等)都会对图像产生影响,难以获取真实的目标信息,所以要通过合理的软件处理使原始数字图像得到适当变化,以适应人的视觉信息和获取特性,更便于图像目标信息的提取。


  三、图像分割
  图像分割是将图像中需要测量的目标从背景中分割出来,以便于计算机对分割出来的图形进行测定分析。图像分割的基本要求是分割出来的图形或区域必须与原来的目标大小及形态相吻合,因此,图像分割的好坏是决定测量精度的关键因素之一。设法从图像中确定并且分离出需要分析灰度相的步骤,称阈值分割。“相”(phase)是图像中我们想要测量部分的总称。测量需通过选择一定阈值来完成,如果所需相比背景暗,那么,所有暗于下限的图像均被选人。例如相的灰度是20~50,20是下限,50是上限,背景的灰度小于20,检测时暗于灰度20的图形均被选人。如果所需相比背景亮,如免疫荧光细胞化学制作的标本,那么,亮于上限的图像均被选人。例如相的灰度是5~20,5是下限,20是上限,背景灰度大于20,灰度20以下的相被选人,而背景是暗于上限的,不被选作测量。如果相暗于图像某些部分而又亮于图像的另一些部分,则需在两限之间的部分选择灰度。
  在检测过程中要使用图像框(image frame)和测量框(measurement frame)。检测只在图像框内进行,框的大小根据需要而定,测量框在图像框之内,是进行测量的部位。两个框之间的部分称为保险区。图像中每个被测物均有其特征计算点(feature count point,FCP),三在被测物的最低点,被测物的特征计算点均应在测量框内,有的被测物可能被测量框截断。那么测量框外的那部分被测物应该位于保险区,即保险区要大于被测物所占的位置,才能观察特征计算点是否在测量框内而决定取舍。这样当换到相邻的区域进行测量时,不会使某图形重复测量,可避免测量误差。选择好目标图像后,计算机控制按一定方式移动放置标本的显微镜载物台,每个部位都将通过测量框,不会遗漏。


  四、测量
  测量是对目标图形的定量描述。只有选择合适的特征参数才能更好地反映目标图形的各项性质,使研究者做出正确的判断。常选取目标图形的灰度、面积、长度、周长、光密度和光强度等作为特征参数。原始参数可由计算机转化成容易理解的数值,例如,面积可由某图形所占像素数转化为平方微米,使观察者容易理解。


  五、统计分析
  依据所得的数据类型,选择正确的统计分析方法进行分析。


  六、结果输出
  通过以上各步骤,得出最终的所需结果。
  以上介绍了图像分析系统的基本概念和显微图像分析处理程序,下面举例说明在免疫组织化学定量分析中图像分析系统的作用。如欲揭示不同条件下大鼠海马CA:区胶质原纤维酸性蛋白(星形胶质细胞标志性蛋白)免疫反应阳性细胞形态和数量的变化,对免疫组织化学染色的大鼠脑海马切片进行显微图像分析。在每只大鼠切片的海马CA,区随意选取10个视野,测定每个视野内胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫反应阳性细胞数量、胞体截面积、周长、平均光密度及积分光密度,再求出它们的平均值及标准误(其中阳性细胞数是在目镜为15倍,物镜20倍的显微镜下,用目镜测微器计算100个方格内细胞数得出的)。分析结果显示:与正常对照组相比,实验组阳性细胞数量约增加0.48倍、胞体截面积约增加1.73倍、周长约增加1.09倍、平均光密度约增加0.20倍、积分光密度约增加2.31倍。所得数据经统计学分析结果表明:实验组与对照组相比,差异有极显著性意义(P0.01)。

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