基因工程疫苗的制备方法

http://www.microimage.com.cnMiffy(2010-10-12 16:16:59)

  1. 制备基因工程苗用酶和载体酶是进行基因工程不可缺少的试剂。用于基因工程的工具酶主要是限制性核酸内切酶和DNA修饰酶(连接酶),限制性核酸内切酶简称限制酶,是一类水解DNA的磷酸二酯酶,用于基因工程的限制酶,主要是能专一的识别4~6个核苷酸序列,并有专一的断裂位置或切点的酶,如EcoRI、HindⅢ、PstI、BamHI等。DNA修饰酶是将目的基因的DNA片段与载体DNA分子在体外连接起来,构成重组体DNA分子,这类酶主要有T4DNA连接酶(从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离出来的)等。
  基因的载体:可以携带外源DNA片段,进入宿主细胞进行增殖和表达,作为基因的载体,应具有以下的特征:能在宿主细胞中自我复制,即使有外源DNA片段与其共价连接也不影响其复制;应具有合适的限制酶识别位点,以便与外源DNA片段连接;应具有某些遗传标记,以便于重组体的选择。常用的载体有质粒(如大肠杆菌质粒pBR322、 pSC101、Co1EI)、噬菌体(λ噬菌体和M13噬菌体)、粘性质粒(由质粒DNA和λ噬菌体的COS区域构建而成,它不但具有以上两种载体的优点,而且能与大片段的外源DNA连接构成重组体DNA分子)及病毒(如牛痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒、乳多空病毒等)。


  2.基本程序大致包括以下五个步骤
  1).分离目的基因,获得目的DNA片段的方法主要有两种,一是直接从细胞基因组中分离,二是人工合成。
  2).将DNA片段和载体在体外连接重组,成为重组DNA分子,多采用连接酶的方法连接。
  3).基因克隆,即将重组体DNA分子,引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。根据所用载体的不同,可选用转化(以质粒作载体时,重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞,以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时,构成的重组体DNA分子,以此种方式进入宿主细胞,可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子,与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒,即人工包装的噬菌体颗粒,引入宿主细胞)的方法,往宿主细胞引入重组体DNA分子。
  4).目的基因克隆的筛选与鉴定,即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子,为了获得摄取了重组体DNA分子细胞,需经筛选,才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来,并作进一步鉴定。筛选含有重组体DNA分子细胞的方法,一般都是以载体DNA及目的基因的遗传标记及分子特征为依据,并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记,因此,在含有一定浓度抗生素的选择培养基上,可以很容易地把摄取了重组体DNA分子,因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。但药物筛选只是一个方面,依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞,还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。
  对于重组体DNA分子的鉴别,通常是在抽提出重组质粒DNA后,用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小,用限制酶酶解,观察其酶切图谱进行。还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定,即将菌落从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上,用碱裂解滤膜上的菌落,使DNA分子游离,变性,并固定在滤膜上,随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交,最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落,并从最初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。 
  5).基因表达,这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译,表达生成的产物(蛋白质),最好在细胞内不被分解,而分泌到细胞外面。表达产物若为较小的多肽,或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质,形成后,通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解,通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因中间,在这种情况下,表达产物是融合蛋白质,融合蛋白质可以抵抗内源蛋白酶的降解,又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。

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