酶联免疫电镜技术操作方法

http://www.microimage.com.cnMiffy(2010-10-12 16:10:55)

(一)原理 
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度,借助于电子显微镜观察,证明酶的存在,从而对抗原进行定位。


(二)材料与试剂
1.PBS液 取NaCl 8.5g,Na2HPO40.85g,KH2PO40.54g,加水至1 000ml即可。
2.DAB溶液 取5mgDAB(3、3二氨基联苯胺)加入10mlTris-HCl缓冲液(0.05mMol/L pH 7.6),加1%H2O20.5ml~1ml。配制时,避光进行,现用现配。在显色完成冲洗过程中,要保持流水冲洗,防止非特异性物质积于标本上。
3.戊二醛固定液 取50ml 0.2Mol/L PBS缓冲液与25%戊二醛按以下比例配制:
0.2Mol/LPBS液         50    50    50    50    50 
25%戊二醛(ml)       4      6      8     10    12
重蒸馏水(ml)         46     44    42    40    28
固定液终浓度(%)  1.0     1.5   2.0   2.5   3.0


(三)操作方法
1.酶标抗体的制备 疫酶技术章。
2.取材 将培养细胞或悬浮细胞用0.1Mol/L PBS液冲洗,离心沉淀后,立即转入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2,4℃固定5min~30min(依抗原性质所定)。如病料为组织块,则取适当大小,先固定1h然后取出,以新的双面刀片切成50~100μm的薄组织再行固定1h~2h。
3.漂洗 以PBS液漂洗过夜,换液3~4次。
4.血清孵育,25℃1h或4℃过夜,孵育的标本放置于加盖的瓷盘内,底层垫数层纱布。防止抗血清干燥凝固,不易洗脱,造成非特异性吸附。
5.PBS冲洗3~4次,每次10min。
6.2.5%戊二醛再固定15min~30min。
7.PBS液冲洗3~4次每次10min。
8.酶标记抗体孵育;用适当稀释的酶标抗体(即工作浓度)于25℃湿盆内孵育1h或4℃过夜。
9.PBS液冲洗3~4次每次10min或4℃漂洗过夜。
10.酶显色处理 将漂洗后的标本浸入DAB-H2O2底物溶液中,20℃,10min~30min。显色强弱与戊二醛的固定有关。若显色弱则可减少甚至取消戊二醛的固定时间。冲洗时必须注意防止非特异漂浮的沉积。
11.常规包埋、切片、电镜观察 在经过脱水包埋确定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色,切片一般在2μm~4μm,切片后染色不存在通透困难的问题。无论在标记染色后切片还是在切片后标记染色,最好在光镜下定位选择后,再做电镜定位包埋,这样目的性强,可减少工作量。


(四)结果判定
在已知阳性、阴性样品成立的前提下,凡出现棕色颗粒,即指示抗原抗体的存在,同时可观察到病毒颗粒的存在,判为阳性(+),否则判为阴性(-)。

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