反卷积分析中的伪像及像差(Microimage译,反卷积软件之三)

http://www.microimage.com.cnCatty(2010-09-30 13:33:54)

 

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    应用了反卷积算法之后,重建的图像有时会出现明显的伪像,例如条纹状(striping)、环状(ringing)斑点或不连续的细胞骨架染色。造成这种伪像的原因:有时是因为数据算法的问题,这种情况使用不同的软件算法或换另一种软件可解决;有时因为输入的原始图像参数不准确;也有时跟计算没有关系,而是由于组织学、光学或电子噪音造成伪像。

判断伪像的来源,第一步就是要仔细比对原始图和反卷积之后的图。如果比对结果发现,原始图中就存在伪像,那么来源就是反卷积的上游操作。如果原始图像中没有伪像,则是在反卷积过程中出现了问题,这时比较不同的反卷积计算方法会比较有效。

 

点扩散因子注意事项

    点扩散因子(PSF)对反卷积计算的准确性起着决定性作用。噪音、异常或不适当的点扩散因子对反卷积的结果有不同程度的影响。对迭代算法的反卷积影响更大,因为迭代算法中要重复使用点扩散因子。所有情况下,原始图中的模糊光线的分布、扩散程度都需要与点扩散因子相匹配。如果使用不匹配的点扩散因子,就可能产生伪像或反卷积图像质量不理想。

    很多商业反卷积软件包,能够选择使用理论PSF还是实际PSF。大多情况下,使用实际PSF,能够得到更理想的反卷积结果。图1是在水浸液中,共聚焦理论点扩散因子示意图。假设用的是油浸物镜,点扩散因子存在明显的轴向扩散,是由于浸油和水之间的折射率差异造成的。图1a)显示当使用恰当折射率的介质时,共聚焦的PSF没有造成像差;当延Z轴增加焦深,点扩散因子的纵向扩散变得明显(图1b-e)。

    当获取实际PSF时,要注意与原始图中的像差要匹配。理想的情况是,原始图和点扩散因子都没有像差。如果主要的像差是在原始图中,这些像差应该与点扩散因子的像差匹配。另外,反卷积图像可能有错误信息或重建得不理想。如果点扩散因子是噪点,反卷积图像中将存在大量的噪音。为了减少噪音和消除小的像差,很多反卷积软件取点扩散因子的平均值,或一些荧光点的平均值,生成比较平滑的PSF

    当使用理论PSF时,点扩散因子参数要设置恰当。包括成像模式、数值孔径、发射波长、像素点大小、Z轴步进,这些值能够显著影响点扩散因子的大小和形状。总的来说,PSF大小随波长的增大而增加,随数值孔径的减小而增加。

    当前绝大多数反卷积软件假设所有的点的PSF是恒定的,这种属性称为空间不变性(spatial invariance)。显微镜光学大致符合这种假设,但是其他因素例如样品中折射率变化或浸物不匹配,会引起点扩散因子的空间变化(spatial variance),尤其是观察厚样品时。现阶段,商用软件都还假设空间不变性,但随着计算机处理速度的日益提高,将来可能会发展到PSF根据图像而变化。

 

球差

    球差是点扩散因子像差中最影响图像质量的因素,也是最难克服的。其影响涉及PSF在形状上的不对称,这增加了PSF的耀斑、降低了亮度。在所有形式的光学显微技术中,球差是降低分辨率和信号的主要因素,包括共聚焦和宽场显微观察。

如果观察的样品相当厚(厚度大于10μm),球差随着观察样品的深度而产生。因此,建议的补救方法是,获取样品所需图像平面内的一点的点扩散图像。但是这个点扩散因子不能用于反卷积,因为大多数情况下,从组织发出的光散射,将使点扩散因子的噪音更大。

球差是成像系统光路的不完美造成的结果。可能源于物镜的瑕疵,更多的时候源于物镜前透镜接触的中间介质。现代物镜,如果使用恰当类型和厚度的盖玻片,适当的浸物和介质,都能够校正或减少球差。这些物质的光学性质对于恰当的从物镜汇聚光线十分重要。

2(牛肺部内皮细胞)由宽场荧光显微镜获取,4个图拍摄条件相同,只是使用了不同折射率的镜油。原始图像(最大强度投影)图2(a)使用了1.514折射率的镜油,没有出现球差。图2(b)2(a)反卷积处理后的图像。相似的细胞,使用更高折射率的镜油(1.524)显示出明显的球差,见图2(c)。细胞周围点的衍射环,就是像差。反卷积之后得到图2(d),箭头右侧指示了出现的伪信号。这种伪像在原始图2(c)中原本是没有的,所以并不是由于成像系统造成的。 

在生物学观察中,物镜浸入物(immersion medium)和封固介质(mounting medium的折射率并不完全相同或接近。这时会出现两种畸变:球差和Z轴缩放(z-scaling)。两种现象都依赖于焦深。尽管z-scaling不影响分分辨率和信号强度,但它表现为因不匹配介质引起的Z轴距离的线性缩放。为了校正这种畸变,Z轴距离可以乘以标准的补偿因子,一些软件提供这一参数。另外,球差很难克服,但是稍微注意就能够改进图像质量,尤其是低光照条件下的观察,如活细胞。

近来一些研究已经定位于球差的数字校正,通过点扩散因子的球差进行反卷积。这要求反卷积软件不自动预处理、补偿点扩散因子的轴向对称。这样,就可以利用实际的点扩散因子,选择最适该图像的,精确的匹配图像中的像差和点扩散因子。这种计算校正也许能在某正程度上复原分辨率,但不能复原丢失的信号。所以校正球差的最好机理是通过光学方法预先限制伪像。

    有各种光学技术和技巧用于校正球差。最常用的就是使用浸入式物镜(dipping objective),可以不用盖玻片直接进入封固介质)。这样浸入介质和封固介质完全相同,不出现折射率不匹配的问题。然而,由于样品和浸入介质之间的折射率差异,或样品本身的折射率差异还是会出现畸变。可用的方法是调整浸入介质的折射率,来补偿封固介质的折射率。如果样品封固在比玻璃折射率低的介质中(例如甘油或水基液),增加浸入液的折射率,将减小或消除球差。利用这种技术,当使用1.4数值孔径的样品,封固介质用甘油时,焦深10-15μm情况下,能够获得相对无像差的图像。一些供应商供应特殊折射率的浸入介质,提供任何想要的折射率。

 

英文原文出处:

http://www.olympusmicro.com/primer/digitalimaging/deconvolution/deconartifacts.html

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