反卷积的算法(Microimage译,反卷积软件之二)

http://www.microimage.com.cnNancy(2010-09-28 16:03:16)

(以下内容由中国显微图像网译制,转载请注明!)

        在过去的十年当中,人们尝试了各种算法来消除数字图片的模糊问题。在光学显微术中,应用最为广泛的算法可分为两类,去模糊(deblurring)及图像还原(image restoration)。deblurring算法适用于二维去模糊,这种算法采取逐层计算的方式还原三维图像。相对的,image restoration则是三维意义上的算法,这种算法以每一个体素为目标同时进行去模糊计算。

        在介绍详细的内容之前,我们先来书记几个术语。object指显微镜视野下被激发的三维荧光。raw image指显微镜下获得的未经处理的数字图片或图片层。features指图片中某一感兴趣的特定区域。

deburring算法
        二维算法比如nearest-neighbor,multi-neighbor,no-neighbor,及unsharp masking在这里,我们都将其归为deblurring算法中。在三维图片层中,这种算法通过逐层计算来去除每一层的模糊。Figure 1显示,为三维图片中的某一光切层面,样品为Xenopus细胞的微管结构。a为处理前图片,b为经nearest-neighbor算法处理后的图片。
        这种单层计算的方式相对来说很经济有效。但deblurring算法也有一些较大的缺点。首先,几个层面中的噪音重叠在了一起;另外,deblurring算法去除了干扰信号的同时降低了信号的总强度;第三,features中的信号在z轴方向上的扩散,在每一个层面中都会计算一次,但实际上某些层面,这些信号是假的,于是features的位置会发生偏移。这种情况在二维图片的去模糊中尤为严重,这些二维图片上,其他层面的干涉环或光经过计算后会被认为是这一层的信号而留在二维图像上。总的来讲,deblurring算法改进的图像对比度,但牺牲了信噪比,并且还有可能引入假信号。
        当需要快速去模糊或计算机性能有限的时候,二维deblurring算法是很有用的。它尤其适用于荧光结构分散的样品,但考虑到这种算法会降低信号强度,最好不要用于形态学计算、荧光定量及比率计算实验。

image restoration算法
        image restoration算法的基本功能是消除三维图像的模糊,效果很理想。这种算法并不是去掉模糊,而是通过运算,逆转图像固有的卷积效应,将模糊的光线算回到焦点位置。假设图像中的object遵循点扩散方程(psf,point spread function)变得模糊,那么通过翻卷积运算,即可将object复原。但是由于成像系统固有的限制以及图像的组成,object无法被完美的还原;只能通过已知的限制因素,估算object。restoration算法通过计算psf还原object。
        这种算法的优势在于,三维图像的翻卷积运算可以遵循傅里叶变换(fourier transformation)通过数学的方法计算出来。

inverse filter算法
        inverse filter是第一个图像翻卷积算法。inverse filter以及与其类似的regularized inverse filters在20世纪60年代被用于电信号的处理,在20世纪70年代晚期被用于图像分析。在图像分析软件中,这些算法通常被称作Wiener deconvolution, Regularized Least Squares, Linear Least Squares, 及Tikhonov-Miller regularization。
        inverse filter也采用傅里叶变换的方法进行翻卷积。这是最简单的翻卷积算法,计算迅速,和前面提到的二维去模糊速度相当。但这种方法是应用受限于噪音放大。在进行傅里叶变换的过程中小的噪音信号会被放大。这样模糊虽然被消除,但引入了更多的噪音,例如所谓的ringing。
        通过估算object的结构可以降低噪音放大以及ringing。例如,如果object相对平滑,那么由于噪音引起的粗糙边缘可以被矫正。这一方法叫做regularization。regularization可以应用于inversefilter计算中的某一步,或反复应用,以得出平滑的结果。然而,由于这种算法可能导致细节的丢失,采用inverse filters算法的应用软件都会提供某一可控参数给用户来控制平滑度与噪音放大之间的偏重。

Constrained Iterative 算法
        为了改进inverse filter算法,人们添加了许多其他的三维算法到图像处理过程中。这些算法被称作constrained iterative algorithms,进行循环计算(因此被称作迭代,iterative)。另外,这些算法不仅消除了噪音及其他问题,同时,还改进了去除信号模糊的能力。

        典型的constrained iterative algorithms遵循以下步骤。首先,对raw image进行初步概算。然后,进行psf的计算,得到结果同raw image进行比较,来检测两者的相似度,并减小错误。然后重新开始新的一轮计算。整个过程将会一直重复,直至错误减小至规定的阈值。最终的结果即为最后一步迭代的得出的object。
        Figure 2中的样品是XLK2细胞的三维模型,由70张0.2微米的间隔光切图片叠加而成。图片由宽场成像系统,采用1.4数值孔径的油镜获得。左侧的标注为Original Data的Figure 2(a)为未经处理的三维图像中的某一层面。标记为Nearest Neighbor的Figure 2(b)为经nearest neighbor算法去模糊后的图片。第三张标记为Restored的FIgure 2(c)的图片经过constrained iterative 翻卷积软件处理过的图片。deblurring及restoration两种算法都提高了对比度,但在deblurring计算后的图片信噪比要明显低于restoration算法处理的图片。Figure 2(c)中的标尺代表2微米,Figure 4中的展示的为Figure 2(a)中的箭头指向位置的信息。
        大部分用于显微图片翻卷积的算法都带有控制因素。最常用的是上面提到的smoothing及regularization。在迭代过程中,会增大噪音信号,大部分计算结果都要通过smoothing及regularization处理优化。
        另外一个常用的限制是nonnegativity。这种限制因素可使结果更真实。其他的限制因素还包括涉及像素饱和度的boundary constraints,对统计的噪音的控制,以及其他统计学上的控制因素。
       
Constrained Iterative Deconvolution的经典算法
        第一个用于显微图像去模糊的Constrained Iterative Deconvolution算法建立在Jansson-Van Cittert (JVC) 算法上。JVC算法为光谱显微术而研发。后来,Agard修正这一算法将其应用在数字显微图像上。现在多家公司的去模糊产品使用这一算法,如Vaytek, Intelligent Imaging Innovations, Applied Precision, Carl Zeiss, 及Bitplane。另外一些研究组开发出regularized least squares minimization方法用于翻卷积处理,这一方法通过Vaytek及Scanalytics.公司出售。这些算法利用额外的或递增的误差准则在每次迭代计算中优化计算值。

Statistical Iterative 算法
        迭代算法中另外一类使用概率误差准则。最大相似度估算(maximum likelihood estimation,MLE)算法及EM算法(expectation maximization )利用相似度(Likelihood)。这些算法被SVI, Bitplane, ImproVision, Carl Zeiss,以及Autoquant等公司应用于翻卷积产品。MLE是科研领取各分支中应用非常广泛的统计学工具。另一种与统计学测量相关的算法最大平均信息量(maximum entropy,ME )被Carl Zeiss应用于图像翻卷积处理。
        Statistical Iterative 算法要比以往方式的计算强度大,所以耗费的时间也长很多。然而,这种通过算法得到的图像质量要比传统算法高。当然,这种算法也引入了控制噪音的限制因素(实际上,利用了Poisson或Gaussian分布);Statistical Iterative 算法对噪音的处理能力更佳,得到的图片噪音也更小。在选择噪音的处理方式时,要考虑到图像本身的因素,一些图像处理软件在这一方面的处理也很灵活。
       
Blind Deconvolution算法
         Blind deconvolution是一项适用于无经验者的新技术,它简化了分析过程,但商品化的软件并不多。这一算法更改了MLE的估算过程,将object同psf一同代入计算。

        Blind deconvolution的效果相当不错,它不仅适用于高质量图片,同时也可以处理噪音较大以及引入了球差的图片。这一算法将理论上的psf应用到需要进行翻卷积计算的图片中。这样,用户节约了用于获取高质量psf的时间。另外,在将psf带入图像的同时,还可矫正一部分球差。然而,这一矫正应作为处理步骤中的最后一步,因为球差应当在获取图片的时候矫正。
        Figure 4中显示为三种不同的算法计算出的图像。原始的三维图片为果蝇胚胎的腿部,整个三维图像共192张光切图片,z轴步进0.4微米,在宽场荧光显微镜下获得(1.25NA 油镜)。图中显示为三维图像中的某一光切层,Figure 3(a)为raw image。Figure 3(b)采用nearest neighbor 算法处理,参数设为去除95%模糊;Figure 3(c)同一层面经inverse filter算法处理后的图像;Figure 3(c)为iterative blind deconvolution结合psf处理后的图像。

共聚焦及多光子图像的翻卷积
        正如所料,共聚焦显微镜及双光子显微镜获得的图像也可以进行翻卷积计算。结合了共聚焦显微镜的翻卷积技术可得到任一技术单独使用时无法比拟的图像质量。对共聚焦图像进行翻卷积处理可减少焦点外信号引起的噪音。对多光子图像进行翻卷积可很好的消除图像中的假信号提高对比度。但需要注意的是,设置psf的值要正确,尤其是共聚焦显微镜的针孔孔径。

翻卷积算法的执行效果
        翻卷积的处理速度及质量极大程度上受软件的算法影响。通过减少迭代次数及加速收敛,可得到较稳定的计算方法。未经优化的Jansson-Van Cittert算法需要50-100次迭代来得到最佳效果。先对raw image进行预处理抑制噪音,并在前两次的迭代中引入误差准则可将迭代次数减少至5-10次。另外,每5次迭代进行一次smoothing处理,可减少噪音放大。
        当根据经验设定psf的时候,最重要的是使用高质量低噪音的的点扩散方程。现在市场上没有哪家的翻卷积软件包使用直接根据显微镜信息建立的psf。软件包通常包含预处理步骤来降低噪音,并对psf执行径向对称。许多软件包还执行轴向对称来消除球差。这些步骤减少了噪音及像差,极大的提高了翻卷积的质量。
        deconvolution算法的应用还需注意的一点,就是对raw image进行预处理。预处理通常包括背景矫正,平场校准,光漂白校准,等抖动校准。这些处理将提高图像的信噪比,并去除一些假信号。大多数的图像处理软件包都具有这些功能,用户在使用的时候需要根据应用的不同查阅相关的细节说明。
        其他翻卷积算法的执行效果注重数据的展现。图像可被分为数个subvolumes或数据块(data blocks)的形式。每个像素(pixel)值以整数或浮点数来表示。傅里叶变换可以浮点数或复数来表示。图像越准确,计算机的内存需要越大,处理的时间越长。因此,需要在计算速度及图像质量间做权衡。

结论
        与deblurring算法及共聚焦显微术不同的是,iterative restoration算法会将焦点外模糊算回它应处的位置,而不是直接去掉这些信号。这样,焦点外的信号也会被利用。在翻卷积之后,荧光结构内的信号增强,但图像的信号总强度不变,而原来模糊的区域信号消失。object周围模糊的细节被算回了焦点位置,object边界变得更加锐利,与背景间的分界更加明显。同时,对比度及信噪比也得到了很好的提高。
        上述特点在Figure 2中体现了出来,翻卷积提高了图像的对比度,因此改进了object的分辨率,同时又不会引入噪音。对图像分析及定量至关重要的是,raw image的荧光信号总强度同翻卷积处理后的图像相同。试用适当,翻卷积将在保留总信号强度的基础上调整信号的位置而提高对比度(Figure 4)。因此,翻卷积处理后的图像可进行定量分析。

        Figure 4中的图表显示了Figure 2(a)中箭头所示位置的水平线上,像素的亮度值。原始数据的亮度值以绿色线显示,deblurring处理后的图像亮度以蓝色线表示,翻卷积后的图像亮度已红色线表示。很明显,deblurring会损失大部分信号,然而翻卷积提高了样品出的荧光信号强度。任何的二维算法都会痛deblurring算法一样,损失图像的信号强度。
        当iterative restoration技术与宽场显微术结合时,处理结果受光的影响。这种作用在光信号很弱的实验中非常明显,比如高分辨率荧光成像这类object很小并且只包含几个荧光子,或如活细胞成像这类曝光时间很短的实验(活细胞对光毒性非常敏感)。

作者

  Wes Wallace- Department of Neuroscience, Brown University, Providence, Rhode Island 02912.

  Lutz H. Schaefer- Advanced Imaging Methodology Consultation, Kitchener, Ontario, Canada.

  Jason R. Swedlow- Division of Gene Regulation and Expression, School of Life Sciences Research, University of Dundee, Dundee, DD1 EH5 Scotland.

  David Biggs- AutoQuant Imaging, Inc., 877 25th Street, Watervliet, New York 12189.

原文链接:www.olympusmicro.com

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