五花八门的细胞器探针

http://www.microimage.com.cnwbf_512(2010-09-27 09:58:34)

  ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------摘要:在细胞生物学领域,由于荧光激发与检测对细胞形态及生理的影响较小,因而当之无愧地成为研究细胞结构与功能首选的示踪方法之一。五花八门的细胞器荧光探针是细胞学研究中重要的一种工具,大概有几百种之多。篇幅有限,生物通特意挑选了几个热门的细胞器,介绍一些明星探针。

  在细胞生物学领域,由于荧光激发与检测对细胞形态及生理的影响较小,因而当之无愧地成为研究细胞结构与功能首选的示踪方法之一。五花八门的细胞器荧光探针是细胞学研究中重要的一种工具,大概有几百种之多。说到荧光探针,Molecular Probes绝对是一块“谁与争锋”金字招牌,2003年被Invitrogen收归旗下。尽管宣传不多,但分子探针这一块的销售额还是随着细胞学研究的进展而节节攀升。没办法,跟着文献走,文献中尽是它。下面这张漂亮的图上标出的细胞器,Invitrogen都有相应的探针。篇幅有限,生物通特意挑选了几个热门的细胞器,介绍一些明星探针。还有更多精彩等着你来发现。。。

线粒体

  线粒体是细胞的能量工厂。因其参与了细胞凋亡,这些年也成为研究的热门。线粒体的荧光探针主要有:JC-1、Rhodamine 123等,Invitrogen还推出专门的MitoTracker 系列探针。

  JC-1是用得最多的。它在浓度或线粒体膜电位低时,以单体存在,激发波长为490 nm,发射波长为527 nm,呈绿色荧光。当浓度升高或线粒体膜电位升高时,JC-1形成J-聚体,呈橙色荧光,此时激发波长为490 nm,发射波长为590 nm。JC-1最重要的应用是检测活细胞内线粒体的膜电位,以及追踪凋亡细胞中的线粒体变化。

  Rhodamine 123是一种能渗透入细胞,带阳离子的荧光探针。它的激发波长为505 nm,发射波长为534 nm。活细胞摄取Rhodamine 123达到平衡的速度较快,只需5分钟,通过激光扫描共聚焦显微镜观察,即可见到线粒体被Rhodamine 123染成绿色。当细胞被反复冲洗时,Rhodamine 123通常不被细胞保留,但许多癌细胞可较长时间保留这种染料,因此,它有助于某些癌症的诊断。

  MitoTracker 系列探针则是Invitrogen专为线粒体而设计的。MitoTracker是细胞通透性的,只要与细胞简单孵育,就能被动渗透质膜,在有活性的线粒体中积累。一旦线粒体被标记,细胞就能用甲醛固定剂固定,一些MitoTracker探针能在固定之后保留在线粒体内。这对致病细胞格外有用。而一些探针在随后的去污剂处理后还能保留,这样就能用在免疫细胞化学或原位杂交中。尽管传统的线粒体探针如Rhodamine 123也很容易标记线粒体,但是一旦线粒体的膜电位损失,它们就很容易被洗掉。这就限制了某些应用。

  MitoTracker探针又分为好几种,且有红色、绿色和橙色。其中还原态的MitoTracker Orange CM-H2TMRos和MitoTracker Red CM-H2Xros在进入细胞后不发出荧光,直到它们被氧化成相应的线粒体选择性探针,并聚集在线粒体内。红色的MitoTracker探针都适合于多色标记实验,因为它们的红色荧光能与其他绿色荧光很好地区分开。尽管有些MitoTracker探针能实现固定细胞中的线粒体标记,但这些染料还是只推荐给活细胞。如果你想要标记固定细胞,可以选择OxPhos的抗体+荧光二抗。

  内质网

  内质网的功能有哪些?你还记得吗?复习一下,内质网是细胞中由膜围成的分支小管、小囊或扁平囊状结构连通而成的管道系统,可分为粗面内质网和滑面内质网两种。粗面内质网上附着有核糖体,是合成蛋白质的主要场所;滑面内质网则功能多样,比如在肝细胞中与解毒和糖代谢有关。

  常用的DiOC6(3) 及相似的DiOC5(3) 都属于短链羰花菁染料,它们广泛用于内质网的研究,包括神经元、酵母中内质网的结构作用和动力学,以及不同细胞类型中内质网、线粒体和微管的形态关系。它们不仅可标记活细胞中的内质网,也可以用于甲醛固定的细胞。DiOC6(3) 进人细胞内与内质网结合,在激光激发下发出绿色荧光,根据内质网的形态学特征很容易识别。需要注意的是,在相对低浓度时,DiOC6(3) 聚集在线粒体中,而在高浓度时,则可聚集于其他膜性细胞器,包括内质网膜。

  长链的羰花菁染料DiIC16(3) 和DiIC18(3) 也可以标记内质网膜。DiIC16(3) 的激发波长为550 nm,发射波长为564 nm;DiIC18(3) 的激发波长为550 nm,发射波长为565 nm,均呈黄色荧光。DiIC16(3) 和DiIC18(3) 的分子结构与DiOC6(3) 大致相同。DiIC16(3)有两个更长的碳链,使Dil不能透过膜。一旦DiI 结合到膜内,它就保留膜中,在膜的两层内自由扩散。DII 已经用来标记神经元细胞和肌细胞的内质网。

  ER-Tracker染料是Invitrogen开发的细胞通透性的活细胞染料,是ER高度选择性的。它们与常规的ER染料DiOC6(3)不同,很少会对线粒体染色,且低浓度下的染色不会对细胞带来毒性。ER-Tracker Blue-White DPX属于Dapoxyl染料家族中的一员,因此有着相当大的斯托克斯位移,长发射波长,以及高的消光系数和量子产率。它的荧光对环境极其敏感,当溶剂极性增加,荧光发射峰会移向更长的波长-从430 nm到640 nm,量子产率下降。Invitrogen推荐用标准的DAPI或UV longpass滤光片来观察它的内质网染色。ER-Tracker Green和ER-Tracker Red的激发/发射峰分别为504/511 nm和587/615 nm。

  真菌代谢物brefeldin A (BFA) 是解析多个胞内进程的重要工具,包括参与运输新合成蛋白的囊泡形成及驱动蛋白分布。将细胞暴露在BFA中,会引起细胞内从内质网到高尔基体的蛋白转运的失常,最终导致高尔基体形态的丧失,而去除BFA后,这些作用会完全逆转。除了天然的BFA外,Invitrogen还提供了绿色和橙红色的BFA衍生物。绿色的BODIPY FL和橙红色的BODIPY 558/568 BFA衍生物能够在几种细胞系中对内质网和高尔基体进行选择性染色。BODIPY 558/568 BFA可与NBD C6-ceramide共同使用,来同时了解内质网和高尔基体。

  高尔基体

  高尔基复合体的功能主要是将由粗面内质网运来的蛋白类物质进行加工、浓缩、储存和运送,最后形成分泌泡排除。高尔基复合体的荧光探针主要有NBD C6-Ceramide 和BODIPY FL C5-Ceramide 两种。

  NBD C6-Ceramide呈绿色荧光,激发波长为464 nm,发射波长为532 nm,是目前应用较广泛的选择性染色高尔基复合体的探针。它适用于活细胞和固定细胞的染色。将荧光ceramide与BSA混合,有助于细胞标记,而无需使用有机溶剂来溶解探针。NBD C6-Ceramide 目前应用在以下方面的研究:检测BFA对高尔基复合体和内质网之间的蛋白转运的作用效果;一种遗传性脂代谢异常的疾病(Farber’s疾病)的研究;细胞内凝血酶受体的转运和标记等等。

  另外,NBD C6-Ceramide的荧光对高尔基体的胆固醇含量特别敏感,这个现象是BODIPY FL C5-Ceramide所没有的。如果含有NBD C6-Ceramide的细胞是胆固醇饥饿的,那么高尔基体中积累的荧光特别不稳定。不过,胆固醇合成的刺激会降低这种NBD光漂白。因此,NBD C6-Ceramide在监测活细胞中高尔基体的胆固醇含量时很有用。

  BODIPY FL C5-Ceramide也呈绿色荧光,激发波长为505 nm,发射波长为511 nm。它比NBD衍生物更加明亮,且不容易衰减,因此在很多应用中都能够替代NBD C6-Ceramide。BODIPY FL C5-Ceramide表现出浓度依赖的荧光特性。在高浓度,非极性的BODIPY FL荧光基团形成受激准分子,使荧光基团的发射峰从515 nm(绿色)转移到620 nm(红色)。反面高尔基体上的BODIPY FL C5-Ceramide积累足够形成受激准分子,而周围的细胞质不会。利用红光的滤光片就能选择性观察高尔基体。而且,这种二色性还能通过比例成像定量BODIPY FL C5-Ceramide的积累。

  溶酶体

  溶酶体为单层膜蛋白包围的内含一系列酸性水解酶的小体。溶酶体中含有多种酶,如糖苷酶、酸性磷酸酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶等等,是物质代谢的场所。

  弱碱性胺选择性聚集在胞内低pH值的小室中,可用于研究溶酶体的生物合成和发病机理。其中最常用的就是DAMP,它不发荧光,需要和抗DNP的抗体共同使用,来观察染色模式。中性红、吖啶橙等荧光探针也常用于酸性细胞器的染色,不过它们缺乏特异性。

  LysoTracker探针就是Invitrogen开发的向酸性荧光探针,用于标记和追踪活细胞中的酸性细胞器。这些探针有几个重要的特征:对酸性细胞器的高选择性,在纳摩尔浓度下能对活细胞有效标记。而且,LysoTracker探针有几种不同的颜色,适合多色标记。

  LysoTracker探针是细胞膜通透性的,一般聚集在球形的细胞器中。研究人员发现探针在极低浓度(~50 nM)下选择性最佳。此外,较大的酸性细胞器在LysoTracker Red DND-99染色后,经过甲醛固定仍保留其染色模式。

  对于那些想研究溶酶体生物发生动力学的研究人员来说,LysoSensor探针可谓量身定做。LysoSensor染料是向酸性的探针,由于质子化作用聚集在酸性细胞器中。质子化也缓解了染料的荧光淬灭,使荧光强度增加。因此,LysoSensor在酸化的环境中表现出pH依赖的荧光强度增加,而LysoTracker探针的荧光则没有明显变化。

  Invitrogen提供了5种LysoSensor试剂,pKa不同,颜色各异。LysoSensor Blue DND-167和LysoSensor Green DND-189的pKa值很低,处于酸性环境中才会发出荧光,而LysoSensor Green DND-153在中性pH下就发出很强的荧光。LysoSensor Yellow/Blue DND-160很特别,具有双激发和双发射峰,是pH依赖的。在酸性细胞器中,它主要发黄色荧光,而在弱酸性细胞器中,荧光则为蓝色。LysoSensor Yellow/Blue DND-160曾与fluo-3 AM共用,来同时测量兔胃腺中H+ 和Ca2+,以确定类胆碱和cAMP依赖通路激活后胃酸分泌的动力学。

  除了上面这些传统的荧光探针,Invitrogen的Organelle Lights?荧光蛋白也是一个不错的选择。Organelle Lights是即用型的荧光蛋白载体,融合了信号肽,能将表达的荧光蛋白定位到亚细胞器中,如核、质膜、内质网、高尔基体和过氧化物酶体等等。颜色有青、绿、橙、红几种。它通过改造的可用于哺乳动物细胞的杆状病毒(BacMam virus)将荧光蛋白导入胞内,不仅安全,而且适合多种细胞类型,包括原代细胞和神经细胞。你只需要将试剂加到细胞中就行了,既不需要转染,也不需要对细胞做任何处理,用起来相当方便。

  讲了这么多,还只是冰山一角。毫无疑问,花样繁多的荧光探针为我们在细胞学研究中提供的更多的选择,不单止美丽,不单止有趣,更照亮了研究的前进之路。如果你希望了解更多其他细胞器的荧光探针,可以向Invitrogen索取相关的资料。各种细胞器探针的超详细分析,不怕找不到,总有一款合适你吧。更多精彩等着你来发现……(生物通余亮)

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