聚焦美妙的荧光:荧光知识充电站

http://www.microimage.com.cnwbf_512(2010-09-27 09:55:46)

  ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------摘要:有了荧光,生物世界开始变得很美妙。由于只需物理方法(光照)即可检测,无需涉及化学反应,亦无同位素的危险,荧光技术早已成为研究生物微观世界中最方便、最重要的示踪工具之一。生物通11月聚焦绚丽多彩的荧光染料,为大家介绍常用的核酸染料、蛋白染料、细胞器染料以及荧光蛋白。在此之前,我们有必要先了解一些荧光的基本知识。

  有了荧光,生物世界开始变得很美妙。由于只需物理方法(光照)即可检测,无需涉及化学反应,亦无同位素的危险,荧光技术早已成为研究生物微观世界中最方便、最重要的示踪工具之一。生物通11月聚焦绚丽多彩的荧光染料,为大家介绍常用的核酸染料、蛋白染料、细胞器染料以及荧光蛋白。在此之前,我们有必要先了解一些荧光的基本知识。

  荧光激发三部曲

  能够发出荧光并能作为染料的化合物称为荧光基团或荧光染料。有的荧光基团本身不发光,可却能特异高效地结合某类生物大分子,并在结合后发出美丽的荧光,比如核酸染料;有的荧光基团本身可以在一定条件下发出荧光,我们需要将这个“明灯”以特殊的方法“挂”在某些可“指路”的生物大分子上,使这大分子变成“指路灯”,可用于定位生物标本中的特定区域或者示踪,这时我们通常称之为荧光探针。

  除了荧光染料,还有一类蛋白质能被激发出各种颜色的美丽荧光,常用于蛋白表达标签而作为示踪或者定量的工具,如大名鼎鼎的绿色荧光蛋白就是其中之一,这个生物通将在后续的文章中另作介绍。

  美丽的荧光从哪里来?请看图1的三部曲。

图1. 荧光激发过程的示意图。(摘自Molecular Probes: The Handbook)

  第1阶段:激发

  激发光源如白炽灯或激光提供了光子能量hνEX。荧光基团吸收能量后,到达单重激发态(S1')。此过程就将荧光和化学发光区别开来,因为后者的激发态是由化学反应引起的。

  第2阶段:激发态的寿命

  激发态的寿命很短暂,通常只有1到10纳秒。在这段时间内,荧光基团经历了构象的改变,并与它所处的分子环境发生了大量的相互作用。此过程有两个重要的结果:第一,S1'的能量部分损失,使荧光基团到达能量略低的S1单重激发态。第二,并不是所有被激发的分子最终都通过荧光发射回到基态(S0)。碰撞淬灭、荧光共振能量转移(FRET)等过程也会使S1减少。

  第3阶段:荧光发射

  在这一阶段,荧光基团释放出光子能量hνEM,回到基态S0。由于能量损耗,光子的能量减少,发射波长总是大于其激发波长,两者之间的差值叫斯托克斯位移(Stokes shift)。在荧光分析中,就是利用斯托克斯位移现象,将激发光与荧光物质的发射光分离开来,只检测发射光,从而提高检测的灵敏度和选择性。有些荧光色素的斯托克斯位移较大,而有些荧光色素的斯托克斯位移较小。斯托克斯位移越大,其激发光谱和发射光谱的重叠就越少,有利于提高其分辨率。

  荧光光谱

  在我们选择荧光染料时,荧光光谱是不可不看的,激发波长和检测波长等重要信息都蕴含其中。激发光谱是通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发波长变化而获得的光谱;而发射光谱是在固定激发波长下扫描发射单色器所测得的光谱。在荧光分析中,可利用激发光谱选择灵敏的激发光波长,利用发射光谱选择灵敏的检测波长。

  在激发光谱上可以看到在某一激发波长下,该荧光染料具有最大的发射荧光强度,则该激发光波长称为最大激发波长λex。在发射光谱上,最大发射荧光强度所对应的波长称为最大发射波长λem。通常会将一种染料的激发光谱和发射光谱放在同一张图上,如图2所示。这是Hoechst 33342与DNA结合后的光谱图,它的最大激发波长为350 nm,最大发射波长为461 nm,中间的差值即为斯托克斯位移。测定荧光时,激发波长在λex、发射波长在λem的检测灵敏度最高。

图2. Hoechst 33342与DNA结合后的荧光光谱。

  荧光仪器

  要想看到绚丽的荧光,除了荧光染料,检测系统也是必不可少的。荧光检测仪器有几个基本要素:1) 激发光源,2) 将发射光子与激发光子分开的滤光片,3) 记录所产生的电信号或图像的探测器。我们经常使用的仪器主要有4种类型,每一种都提供了完全不同的信息:

  · 荧光分光光度计和微孔板读数仪主要测量大量样品(微升到毫升)的平均性质。

  · 荧光显微镜在二维或三维的空间座标中解析微小物体(直径小于0.1 mm)的荧光。

  · 荧光扫描仪,包括芯片扫描仪,在二维的空间座标中解析大物体(如电泳胶、印迹和层析图)的荧光。

  · 流式细胞仪测量流动束中每个细胞的荧光,鉴定并定量大样品中的亚群。

  其他类型的仪器也能进行荧光检测,如毛细管电泳装置、DNA测序仪和微流体设备。每种仪器对荧光探针的要求都不尽相同。比如,对荧光显微镜而言,光漂白是一个大问题,但是对于流式细胞仪来说,这不算什么,因为光源照射细胞的时间很短暂。

  如何选择荧光染料

  现在市场上的荧光染料也是越来越多,光是著名的Molecular Probes(03年被Invitrogen收购),目录就是厚厚一本,相同用途的染料也分好多类,真是眼花缭乱,不知该如何下手。其实也不必这么纠结,搞清楚以下几点就行了。首先,你的用途是什么;其次,了解仪器的特性-激发波长和滤光片,然后再结合光谱图来选择合适的染料。如果还是有多个选择,那么可以比较一下它们的量子产率、光稳定性、pH稳定性等等。一般说来,荧光基团的量子产率要在0.35以上,才能用于荧光分析。另外还要注意染料的通透性,特别是细胞器染料,会分为活细胞和死细胞两种,一定要看清楚了。

  生物通小贴士:初次使用的人士还是多看看文献吧,一来可以导购,二来可作为实验的参考。荧光染料这种化学物质,它的说明书一般都不会很详细,只是泛泛地列出了使用的浓度范围,你千万别指望有质粒抽提试剂盒那样的protocol。小编曾经就这个问题问过相关的技术人员,他的回答是,这东西就像酱油,只能告诉你做菜加一点,具体是加5滴还是一勺,那只能是自己摸索。

  多色标记

  当多重分析成为一种潮流,更多的实验也开始引入两种或以上的探针,来同时监测不同的生化功能。这种多色标记技术主要应用于流式细胞仪、DNA测序、荧光原位杂交和细胞器标记中。在选择同时使用的几种荧光探针时,必须注意荧光染料的发射光谱需要足够分开,才能有利于信号分离和数据分析。一般选择发射光谱没有交叉或交叉小,发射峰值波长不同,荧光发射强度相当,在仪器上各荧光信号彼此能够分开的荧光探针标记样品。因此,那些光谱带宽窄的染料更受欢迎,比如Molecular Probes的Alexa Fluor系列。当然,最理想的组合是那些激发波长一致,而发射波长相去甚远的染料。但理想归理想,这样的组合往往不多见。

  光漂白

  提高激发光的强度可以提高荧光的强度,但是,激发光的强度不是可以无限提高的。因为激发光的强度超过一定限度时,光吸收就趋于饱和,并不可逆地破坏激发态分子,这就是光漂白的现象。对于荧光显微镜和激光共聚焦显微镜而言,光源需长时间照射样品,光漂白现象就可能严重影响测量。

  解决光漂白问题的最有效办法是增强检测灵敏度,这样就能降低激发光的强度。使用CCD照相机等低亮度的检测装置,以及高数值孔径物镜和最宽带通的滤光片,都能增强检测灵敏度。当然,最好是选择一些光稳定性更好的染料,例如Alexa Fluor 488染料就比FITC要强得多。另外,你也可以使用抗淬灭剂。目前市场上用得较多的是Molecular Probes的SlowFade和ProLong试剂,它们可以降低光漂白,不过不能用于活细胞。但需要注意的是,这些方法只是仅供参考,是否奏效还很难说,因为在某种程度上,光漂白速率还取决于荧光基团所处的环境。

  本文只是对荧光染料的最基本知识作了简单介绍,属于扫盲班类别,如果你想更深入地了解它们,建议你向Invitrogen索取大部头的《Molecular Probes: The Handbook》或一些中文版的书籍。后面我们将会介绍常用的核酸染料、蛋白染料、细胞器染料和荧光蛋白,敬请期待……

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