反卷积分辨率标准和性能的问题(Microimage译,反卷积软件之四)

http://www.microimage.com.cntina(2010-09-14 12:11:21)

(以下内容由中国显微图像网译制,转载请注明!)

一、             反卷积的分辨率的计算和相关参数

光学显微镜的分辨率常由瑞利准则评估,原先它主要用于确定二维显微镜图像的分辨率,现在已逐渐蔓延到光学的其他领域。

 

瑞利准则的定义是:来自同一个标本两点间可分辨的最小距离。这个距离不会根据图像放大率大小而改变。二维图像中,如果他们的艾利斑衍射模型很清楚,两点间距离就能分辨。如果两个艾利斑离得比大艾利斑和小艾利斑重合的距离更远的话,艾利斑就能被分辨清楚。如果两点间距离等于波长,那么艾利斑的直径相同,瑞利准则等于其中一个艾利斑的半径。至于一个特定波长的单色图像,瑞利准则可以利用显微镜教科书上的标准公式定义:d = 0.61λ/NA

d是瑞利准则,λ是激发波长,NA是物镜的数值孔径,d越小,分辨率越高。

1展示的是从光的两点光源产生的运算光强度(蓝线),我们认为这个文件代表了穿过艾利斑的线所具有的像素强度(实际上,是焦点上PSFXY图像)。

上面的公式在评价平面图像时有用,但不适用于显微镜的光轴(Z轴),这是反卷积技术成功分析的关键。然而,Z轴瑞利准则的适用公式利用相似原理可以被推断出。当两点间的轴衍射能分清时,两点之间能分辨的最小轴距离就出来了。复杂的是光源的Z轴衍射模型不是艾利斑形状,而是在X-ZY-Z平面沙漏状的PSF图像。不过,这个沙漏像艾利斑一样有个明亮的中心地带。因此,Z轴瑞利准则可以定义为沿Z轴中心亮带从最大化强度到最小化强度第一个点间的距离,这个值可用以下公式算出:d = 2λη/(NA)2

注意这个公式有η,是浸入介质的折射率。假定浸入介质有相同折射率,否则球差会导致分辨率下降,读者也应注意到所有的讨论都会先假定无像差存在,实际上却是不可能的。

仔细研究以上的Z轴分辨率公式,发现降低浸入介质的折射率可以提高Z轴分辨率。然而,因为当介质折射率变小时,物镜数值孔径会变小,因此这个现象不会发生,因为Z轴分辨率会随着数值孔径平方的改变而变化。这个重要的不同意味着X-Y分辨率和Z轴分辨率都会因为增加数值孔径而提高,但Z轴分辨率变得更明显些。

Z轴分辨率虽和景深紧密相关但却不是同一概念。经典的景深概念是有着特定焦距的显微镜中,样品在焦平面最后图像的厚度。当检测一个二维图像时,样品的某些部分都聚焦在一个平面上。特点是看起来都在焦面上的图像实际不在一个平面,焦面的清晰有时候是主观判断,但标准的焦深单位常被定义为Z轴瑞利单位的一半:d = λη/(NA)2

另一个取代轴瑞利准则常用的标准是PSF中心明亮区域一半的宽度(FWHM)。计算共聚焦上FWHM的公式出现在几篇显微镜综述中,和以上提到的宽视野显微镜中的瑞利准则一样。应当强调的是这些都是粗略描述,他们不是精确的分析公式。

应当明确的是任何分辨率准则并不是分辨率的绝对指标,但在比较不同成像条件时,是有用的。瑞利准则特别适合于两个自发样品的辨别。其他情况下,如DIC、明场、暗场显微镜等,其他标准也适用。在某些应用中,例如一个移动样品的定位,低于瑞利局限的分辨率是可能的。突出的现实是分辨率是依赖于当时的条件,不能任意定义。

另外,分辨率很大程度上依赖于图像的衬度或从背景中分辨样品信号的能力。衬度大致依赖于样品准备技术,如固定质量、抗体渗透、染色的均匀性、荧光基团的褪色、背景荧光:相对光学和计算技术,优化样品准备方法可以低成本的大大提高分辨率。然而,假定样品制备是高品质的,任何应用的分辨率限制总是依赖PSF

二、分辨率和衬度的提高

质疑迭代反卷积对图像质量量化提高的程度是很正常的,还有怎么才能最好的计算和比较不同运算方式的表现。评价的手段之一是在反卷积之前和之后分别测量大小和亮度。图2显示出利用油镜(NA=1.4)宽场成像系统下荧光珠亚分辨率下(0.1mm)层叠图像的数据。收集数据前,我们最小化各种像差。因为没有来自其他物体的非焦信号,所以这个珠子代表了一个近似理想的样品。

 

2中,黄线代表原始图像数据,红线代表迭代反卷积处理后的图像数据。为了换算以上图例,每个强度值都被常态化。没有这样的常态化,来自原始图像的数据将会很少能在图标上显示,因为焦面旁边的像素强度在复原图中太明亮了。然而,两个表中每个图像叠加的全部强度都一样。

为了量化迭代反卷积提高的分辨率,我们分别在重建图像之前和之后以穿过珠子中心的光轴平行线来测量像素强度。每个像素的强度都被标绘(2(a)),常态化后,做为从珠心沿Z轴距离的函数。Z轴强度轮廓的FWHM做为珠子的直径,原始图像测量是0.7mm,重建图像测量是0.45mm。这种由于重建少量提高的分辨率很少用于展示生物样品结构,因为它在原始图像中是看不到的。

重建导致的重大变化在2(b)中清晰可见,那代表了每个焦平面上所有像素值的总和。和原始数据相对应的曲线显示出距离珠子2mm非焦平面的强度。迭代反卷积引起的重建把大部分非焦平面的强度移回原始焦面。结果是图像衬度有很大提高,使得能更容易的分辨和区分图像中的特征。绘制数据时,原始和重建图像每个焦面像素强度的总和都被根据最小化、最大化叠加图像平面标准化。总的强度被标出做为从珠心的焦距离函数。从非焦面到焦面信号强度的存储产生了一个重大的衬度提升,也带来了信噪比的提高。然而,应该指出在原始数据和重建数据中,整个图像强度的整合是一样的。

制图时,原始和重建图像每个焦平面像素的总强度都被标准化成叠加图像平面的最大化和最小化值。强度的总和被标注成自珠心的焦面距离函数。非焦平面到焦平面信号强度的重建产生了重要的衬度改善,也提高了信噪比。

以上讨论概括了迭代反卷积运算性能检测的方法。运算测定产生的重建为显微镜学家展示了另一个难题。许多网站比较了应用不同运算产生的结果,但这样的比较会产生许多误解。首先,就像图2中的数据,通过运用它们重建球面物体的图像,运算方式常被比较或者甚至计算得来的理想物体的图像。受测试物体的表现和真实生物样品的表现之间的关系并不是很直接。此外,除非定量化对比,已知物体的大小,要不很难评价是否一个合意的结果真的更准确。例如,运算将会改变物体的特征,使得它们的图像看起来更锐利,但会混淆测量。

另一个问题,运算的对比通常是由对比较结果感兴趣的机构发布的,这使得结果会有偏见性。通常这些机构将他们多年来开发和完善的反卷积算法和一个没怎么优化好的算法相比较。然而,像以上讨论的,在速度、稳定性、分辨率提高等方面巨大的差异跟细节执行和算法优化有关。因而,唯一公平的是现有软件包之间的对比,而不是基本算法的比较。

专家强烈建议要购买反卷积软件的用户一定要比较不同软件包对他们数据的处理表现,这或许需要很大的决心,因为很多公司的销售将图像保存成一个专有的图像格式,竞争对手的软件常不能打开。要比较不同软件包重建的图像,确定图像保存成统一格式是很必要的。目前,最普遍的是存储一叠TIFF次序图片,每张都代表了三维图像的焦面。最好是有一堆实例图像文件和PSF文件,然后被不同软件处理后做比较。应用自己的图像和PSF运算评估的好处在于,熟悉特定的样品处理准则、物镜、放大率、噪音水平、信号强度、球差程度、以及其他能极大影响反卷积质量的变量。

三、电脑速度和存储对反卷积处理的影响

提高计算机处理器的速度、安装随机处理器(RAM)、提高总线速度能大大增加反卷积速度。在反卷积处理中,代表不同图像格式的数据同时存储在RAM,在电脑内经由母线移动。因此,和总线的速度一样,对于快速处理三维图像,RAM的容量是至关重要的。一般来说,图像处理计算机应当配备比要反卷积处理的图像大三倍的RAM。另外,有着快速母线速度的计算机表现更优异,甚至中心处理器慢点也无妨。

通常由计算机操作系统记录图像文件的大小,然而,如果拿不准,就可以用每个像素的字节数乘以像素数计算得出。图像原始的bit深度由数字图像捕捉系统设定,将会产生每个像素8101216bit的灰度值。一旦获得图像,bit深度常被软件包和计算系统确定(通常是816bit8bit=1byte)。多色图像中每个颜色通道需要分别存储和反卷积处理,所以必须小心确定整个图像的bit深度,而不仅仅只确定每个颜色通道的bit深度。举例如下:一个三维图像的叠加,每个面是512x512个像素,64个光切面,三个通道,每个像素8bit,计算结果如下:512 × 512 × 64 × 3 × 1 = 50 megabytes (MB)

作者:

Wes Wallace - Department of Neuroscience, Brown University, Providence, Rhode Island 02912.

Lutz H. Schaefer - Advanced Imaging Methodology Consultation, Kitchener, Ontario, Canada.

Jason R. Swedlow - Division of Gene Regulation and Expression, School of Life Sciences Research, University of Dundee, Dundee, DD1 EH5 Scotland.

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