激光捕获显微切割技术在法医DNA检测平台中的应用

http://www.microimage.com.cn田英芳,魏朝明,张洪波,朱波峰(2010-07-13 18:39:29)

各种荧光标记复合STR GeneScan技术的发展,为法医DNA检测提供了强有力的技术支撑,使微量及腐败检材的分型成为可能,扩展了法医DNA检测的范围,实现了法医DNA检测的微量化,自动化和标准化。 但在日常检测中,混合检材的问题一直困扰法医DNA检测人员,如混合斑中精子DNA的分型;检测者虽然可以通过两步法提取去除女性成分的干扰,或通过Y-STR的检测达到检测男性成分的目的,但检测效果一直不理想[1];早期中止妊娠的胚胎组织,母体成分与胎儿成分的分离检测,也一直是检测的瓶颈,有研究者采用手工显微切割技术分离流产组织中的胎儿成分,虽然获得成功[2,3],但手工显微切割不仅耗费人力,而且精度难以保证,不能完全去除母亲成分的污染。 1996年美国NIHLitta实验室开发的激光捕获显微切割LCM (laser capture microdissection, LCM)技术可在显微镜下利用激光从组织切片或细胞涂片中俘获并切割单一类型细胞群或单个细胞[4] STR的灵敏性与LCM技术的特异性捕获相结合,在很大程度上解决了以上问题.


LCM技术最早是为美国肿瘤基因解剖计划(cancer genome anatomy project, CGAP)开发的一项新技术,该技术操作简单,定位准确,可在短时间内获得大量的单一细胞,用于研究正常细胞向肿瘤细胞演进过程中基因结构和表达的动态变化。随着该技术的发展完善以及与各种分子生物学研究方法联合应用,LCM技术逐渐渗透至科学研究的各个领域,用于各种类型的组织或细胞分离。但在法医学领域的应用,开展的并不广泛,现就有关文献综述如下:

LCM在法医DNA检测平台中的应用。

1.1  混合斑中精子的分离。混合斑的检验一直法医学上的难题,其困难就在于混合斑中的各种组份难于分离。因此,混合斑检验的结果往往表现为各混合组份的分型相互并存,或女性成分呈优势扩增的现象,使结果的分析变得很复杂, 近年来由于技术的发展,Y-STR新标记的发现,混合斑的分型及结果的解释也出现一些新的思路,但结果仍难以满足检案实践的需求[1]。关于混合斑中男性成分的分离,法医学工作者进行了许多尝试,Elliott等利用LCM捕获分离混合斑中的精子,并与两步提取法的分型结果相比较,研究结果表明:对于相同数量的精子,尤其是精子数目相对较少时(数个或数十个),LCM法与两步提取法相比较,前者能获得更好的男性DNA分型图谱[5]。周怀谷等应用LCM技术成功地捕获了混合斑中精子和阴道上皮细胞,并进行了相应的分型研究,相对于25 个以上的上皮细胞就能得到有效的检测结果,精子细胞却需要 100个,结果表明LCM技术可以收集有限的检材,排除干扰物质,从而可以使一些现有技术无法检测成功的检材也能检测成功[6]。张健等探讨了常见生物学检材涂片的单细胞捕获方法,证明即使不通过染色,也可以通过形态学特征识别精子,从而进行有效的捕获[7]

1.2  胚胎组织中胎儿成分的分离。

早期胚胎组织由于过小,胚胎绒毛组织深入子宫,极易与母体组织混淆,给取样带来困难, 尤其是破坏性的早期流产胚胎组织中,母体成分与胎儿成分的有效分离,一直是检测的瓶颈,母亲DNA常常呈现优势扩增,有研究者采用针头,手术刀片等手工显微切割技术分离流产组织中的胎儿成分,虽然获得成功[2,3],但手工显微切割不仅耗费人力,精度难以保证,且不能完全去除母亲成分的污染。在混合斑检材中广泛应用的性别遗传标记对此也无能为力,虽然随着检测技术的发展和数据分析技术的提高,流产组织中胎儿DNA分型问题被部分解决,但STR分型技术的灵敏性对检材的要求无疑更高,微量的母亲成分的污染就会导致混合谱带或分型失败。针对病理学检验保留的包埋组织块或石蜡切片,国外法医学工作者利用LCM技术捕获胚胎绒毛细胞,获得了理想的分型结果,50个绒毛细胞获得的DNA即可产生完好的分型图谱[8-10]

2 LCM技术步骤 

2.1 组织块的制备及保存  冰冻或石蜡包埋处理的组织皆可用于LCM,石蜡包埋组织可以长期保存,并且很好地保持组织形态学特征,但因前期的处理,可能使核酸的结构可能受到一些破坏,冰冻组织较完整的保存了蛋白质及核酸的完整性,但需要冷冻的保存环境。依常规组织前固定后,即可制备冰冻组织块或石蜡包埋组织块。固定剂的使用与选择因研究对象不同而异,有文献认为,甲醛固定可以有效的保护组织中的DNA,使用甲氧基乙酰苯胺(methacarn)固定组织时,RNA产量与DNA产量均处于比较满意的水平[11] 。依据我们实验室实践以及我们国家的现实状况,对于边远地区,可在医院就地取材,使用75%的酒精进行前固定,也可以获得较好的DNA得率。经过前固定的组织块,可以长期保存。但很多情况下,我们能够获得新鲜的流产组织,此时可以直接行冰冻切片,既省去包埋组织的麻烦,又可获得较高的DNA得率。

2.2 切片  组织LCM切片制备与常规病理切片基本相同,只是因为涉及到后期的STR分型,避免污染成为最大的防范措施。切片前,载物台,机箱内部均应使用75%乙醇擦拭,晾干,如有可能,紫外照射30分钟,尽可能使用新的刀片,同时,载玻片不应涂布任何黏附剂,否则,组织与载玻片紧密结合,影响捕获。冰冻切片的厚度一般在10um左右,较厚的切片容易捕获到较多的细胞,但有可能导致非特异性的捕获上下左右邻近的细胞,较薄的切片捕获细胞量相对较少,但捕获的细胞比较纯净[12,13]

 2.3  染色  对于混合斑涂片,即便是不经过染色,精子的形态在显微镜下也是比较容易辨认的。普通的HE染色即可用于混合斑涂片以及流产胚胎组织的染色。经过染色,可以更好的显示组织的形态结构,有利于研究者方便快速的辨别所需要的组织细胞类型,有效的缩短捕获时间,但染料的存在会在一定程度上影响PCR扩增。为了避免污染, 建议不同样本的切片或涂片使用不同的染缸,以避免污染。同时,切片一定要脱水完全,一般来说,脱水不完全是造成捕获失败的最重要的原因。切片脱水后,由于后期要进行LCM,所以最好不要封片,因此造成的组织的收缩及衍射现象的发生会导致出现浅褐色的背景,所以,捕获前应反复对照封片与未封片的形态组织结构变化,以提高捕获的准确性及捕获效率。

2.4  LCM捕获  Arcterus Pixcell II激光显微捕获系统备有两种捕获帽子,普通型的帽子捕获面积大,适于捕获目标较多,捕获量相对较大的组织,但因帽子边缘与组织紧密结合,有时会有非特异性组织黏附下来,敏感型的帽子(HScap)捕获面积要小得多,帽子上带有支架,捕获面与组织不直接接触,可获得比较纯净的细胞类型,在法医DNA检测中,我们推荐使用敏感型的帽子,因为切片的平整与否会影响到捕获的效果,尤其是在混合斑涂片中,不可避免的有许多杂质,难以保证涂片表面平整,而带支架的敏感型帽子可以部分弥补次缺陷,并最大限度的去除非特异性黏附。如捕获效率不够高,一般来说,会归因于切片脱水不够完全,适当的延长乙醇脱水时间,以及二甲苯中停留的时间,可以有效的解决这一问题。

2.5捕获组织或细胞的 DNA提取。

捕获后的含靶组织或细胞的帽子,如不立即进行DNA提取,应于低温且无污染的环境保存。提取方法可遵循微量DNA提取原则,常见的方法归纳为以下5:1. Chelex-100法。捕获结束后,可将EVA膜用镊子撕下,投入装有Chelex-1000.5ml离心管中,或将帽子直接盖在装有Chelex-1000.5ml离心管上,倒置孵育,按常规Chelex-100法提取,或稍加修改进行[8]。此方法比较简单,损失小,得率高,但因为无法浓缩,提取终体积相对较大,DNA浓度较低。2.酶裂解法。标准缓冲液中加入蛋白酶K孵育靶组织或细胞, 高温灭活酶K后,即可取上清进行PCR反应[9,10]。此法的优缺点与Chelex-100法类似。3.有机溶剂法,由LCM所得的靶组织细胞数一般不会太多,有机溶剂法虽然可获得较纯净的DNA,但损失较大,故基本上不推荐使用。4.商品化的微量DNA试剂盒提取法[5,6]。相对复杂,成本较高,但浓缩柱会使提取终体积相对较小,DNA浓度高。以上方法,研究者可根据本实验室微量检材DNA提取方法进行相应的改进。

3.LCM在法医DNA检测平台中应用的局限性及展望。

从现有的文献看,LCM在法医DNA检测平台中的实际应用,仅限于混合斑中精子与内皮细胞的分离,以及流产组织中胎儿绒毛的分离,虽然对于相同数量的检材细胞,捕获技术的应用提高了STR分型的成功率,但需要的细胞数相对还是较多,从数十到数百不等[5,6,8-10]。虽然LCM技术可以实现单细胞捕获,但只有将LCM的优点与单细胞DNA分型技术结合起来,对于实践中真正棘手的轮奸案中混合精斑中不同男性精子DNA的分型等案件才更有意义。成熟的可以应用于检案的单细胞DNA分型技术现在还未出现,但随着全基因组扩增技术的发展[14,15],单细胞DNA分型技术日趋成熟,四川大学邓建强博士系统的研究了全基因组扩增技术在法医学DNA分型技术实践中的应用,探讨了全基因组扩增过程中对微卫星位点的影响,并提出了行之有效的解决办法[16]。总之,随着LCM技术,单细胞全基因组扩增技术以及微量DNA分型技术的不断发展和完善,法医DNA检测技术有望得到质的飞跃,在实践中实现单细胞水平DNA分型。

【参考文献】:

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[5] Elliott K, Hill D.S, Lambert C, Use of laser microdissection greatly improves the recovery of DNA from sperm on microscope slides [J]. Forensic Science International.2003, 137:2836.

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[7]张健,胡兰,张惠芹,等.利用LCM技术从生物检材中提取单个细胞[J].中国公安大学学报(自然科学版),2005,1:14-17

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[11] Shibutani M, Uneyama C,Miyazaki, et al. Methacarn: a fixation tool for multipurpose genetic analysis from paraffin-embedded tissues[J]. Methods Enzymol, 2002, 356:114-125.

[12] 田英芳,张蓬勃,刘勇.激光捕获显微切割技术及其在脑研究中的应用[J].解剖科学进展, 2005, 11 (2) : 170-173

[13] 田英芳,魏朝明,刘勇,等.激光捕获显微切割大鼠脑微血管神经元的功能分类表达谱芯片研究方法[J].西安交通大学学报(医学版)2005, 26(4): 395-401

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[16] 邓建强.全基因组扩增技术应用于法医学实践的系统研究[M].中国优秀博硕士学位论文库.

【基金项目】国家自然科学基金资助项目(No30170300),陕西省自然科学基金资助项目(2004C263

tianyf18@mail.xjtu.edu.cn

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