电动显微镜(Microimage译)——活细胞成像专题之三

http://www.microimage.com.cnCatty(2009-09-01 13:45:47)

 中国显微图像网专题文章 

(以下内容由中国显微图像网译制,转载请注明!)

 

电动显微镜的组成和附件使观察者自动获取活细胞图像,尤其适用于时间序列实验,从毫秒到几十、几百分钟都可以实现。有广泛可选的附件部件,如电动光闸、电动滤色块转盘、电动载物台、电动调焦部件, 可以对研究级的显微镜进行更新,可以交互式的由计算机软件平台控制。然而,要指出的是,配置一台全电动的、多维光学成像系统是件及其复杂的工作。

通常购买整套的系统应用(价格昂贵),可由多个用户共同承担、使用。另一种办法是,通过自己组装一个系统,可以节省至少50%的花销,但这种做法仅限于对光学显微镜有足够经验的实验室

 

一、光闸

    电动光闸用来关闭照射在样本上的光源,尤其是在荧光样本成像的时候尤为重要,因为光源的控制可以降低光漂白和光毒性现象发生。

    为了保持细胞活力,光闸在长时间活细胞成像中非常重要。除此之外,光闸还可以选择不同光源的路径,比如在时间序列(time-lapse)观察中每一个时间点要采集两个图像,这时就需要光闸快速的转换透射光和荧光。现在的高性能光闸是由微处理器控制的,有多种运行模式,可以使用户根据不同需要设置。快速模式(fast mode)可以以最快的速度开关控制光闸。一个稍慢的轻柔模式(soft mode)可以慢慢的开关光闸来降低样品的震动。在不影响波长的前提下,控制光强度就需要使用灰密度光闸模式(neutral density),精确的控制光阑孔径的大小,这时它的作用相当于中灰度滤光片。很多光闸控制器提供了一些操作模式,可以与一个或者多个光闸结合操作。

   

2是活细胞成像显微镜中常用的光闸图片。图2b是图2a的剖视图。图2c所示的滤色片转轮光闸可以单独使用或者跟电动滤色片转轮结合使用,这样可以同时准确的控制波长和曝光时间。

    显微镜用的光闸孔径范围在25-35mm。孔径越小,运行速度越快,但是常常限制视野范围,在有的显微镜中还会产生渐晕现象。大孔径的光闸运行速度较慢,但是可以降低或者去除边缘效应 光闸的外部通常是用铝铸造的,阳极氧化;后涂成黑色作为散热装置。很多光闸为了增加使用灵活性而不铸造,但是这样会使内部元件暴露而受到灰尘污染。为了降低光闸的热量(与热电弧放电灯配合使用),光闸在对着光源的输入侧要有反射片。典型的高端反射涂层是由铝镁氟化物镀成的,而比较经济的光闸片是由抛光的不锈钢制成的。后者的反射性和散热性都要差于合金涂层,但是价格要低而且使用时间要长一些。

 

二、波长选择

    目前,有很多自动转换的荧光滤光片可供选择。最普通的滤光片转轮较耐用,相对便宜,有很多售后市场支持并跟很多系统兼容。滤光片转轮的最大缺点是转换速度的限制。而比较好的滤光片转轮转换速度非常快,可以跟很多商用滤光片一起使用。多色荧光成像系统中最重要的部分之一就是快速波长转换的一个装置,无论是通过多种滤光片,光分束装置,单色器或者可调声光控制器(AOTFs的使用来达到这一目的。在标准配置中,常用的荧光滤光片装在光学遮挡处,包括激发和阻挡滤片(发射滤片),还有二色反射镜,它将激发光传递到样品以及将发射光传递到探测器。活细胞成像中常使用更高级的滤光片,二色反射镜一般是保留的,但是也常用含有多带通区域的多色反色镜。激发和发射滤光片常从光学遮挡部位移除,取而代之的是装上以下外部装置。

    滤光片转换轮的设计宗旨是必须要可以装配圆形、平的光干涉滤光片,中灰度滤光片,热滤光片和紫外光滤光片,同时可以容纳4-10个滤光片直径在25-50mm之间(见Figures 3 4)。转轮装在一个铝壳体内,能很容易的更换滤光片,由一个精确的步进马达控制外部结构。壳体包括一个光学部分可以通过使用特殊的适配器附着在显微镜和光源上,很多转轮的壳体也能容纳螺栓固定的光闸。高端的滤光片转轮配有安装耳结构,可以使壳体安全的固定在操作台上。有些滤光片转轮的设计还有可以推入和拉出的外部滤光片框架。滤光片转换模块是通过内部微处理器控制的,可以跟很多滤光片转轮、光闸、数码相机及其他设备通过工作计算机操作。

    标准的经济型滤光片转轮转换时间为100ms,而更贵更快的转轮可以达到25ms。虽然乍看速度都很快,但是转换的时间尺度需要至少4s来记录两个波长之间的转换,因此,严格的限制快速细胞过程图像获取时间是非常必要的。 除此之外,滤光片转换轮可能产生机械振动,会牵扯到探测系统进而引起图像质量下降。在与显微镜主体直接接触时,滤光片转轮和光闸的操作过程会产生振动,振动会持续几百毫秒。这些情况都会降低图像分辨率。

   

振动的问题在商业研究级显微镜是很常见的,这其中包括了很多电动组件的问题。生产厂商通常限制附加设备的速度(比如轴驱动,物镜转换器和聚光器)或者在电动控制和图像获取起始时引入时间延迟。然而,在很多情况下,这些时间延迟会降低系统的整体性能,还常常将样品暴露在不必要的光下。这些生产商也增加了很多产品条目,包括电动光闸、滤光片转换轮、荧光方形转台、端口控制器和相关附件,所有的这些元件都可以用一个控制器控制。这些外围的设备保证观察模式可以快速的自动转换,是活细胞成像系统中的理想配置。上述提供的配件在物镜转换的时候,可以补偿焦点,调节精细焦点的敏感度和协调各部位的电动功能,这样就保证了时间序列不会受到干扰。

    很多型号较老的显微镜不能安装厂商新出的周边产品,因此要想配置就必须咨询售后市场,让他们提供技术支持。在安装这些配件的时候,必须要慎重考虑灯箱、滤光片转换轮和光闸安装在显微镜外部独立的位置,这样可以减少震动,并且不需要时间延迟就可以实现各个配件的同步运行。在大多数情况下,安装显微镜周边配件需要各配件精确的组合,这样才能使显微镜达到最好的性能状态。图3所示的就是一个可以降低震动的滤光片转换轮和光闸组合。图中的所有元件都安全的安装在实验电路板或者单独的台面上,在滤光片转换轮和显微镜与摄像头之间有1毫米的空气间隔,可以降低震动。在图3(a)中,照明校准器直接安装在滤光片转换轮的光闸上,由铝支柱支撑。光闸和焦距变换器之间的空隙能阻止光闸的快速移动而影响显微镜的运作。与此类似的是,在图3(b)中,光长和显微镜框架间的空气间隙以及摄像头和滤光片转换轮之间的间隙也起到同样的作用。

    在型号较老的显微镜的发射部位安装滤光片转换轮时,还需要考虑到另外一个潜在的因素,就是这样做可能会影响齐焦性,而造成带通波长改变,和引起色差。由于显微镜光学系统的配置不同,在现存的出射光束中插入发射光滤光片可能会改变焦平面。这种情况的严重程度由滤光片的厚度和折射率决定。除此之外,通过带通滤光片不同角度聚焦的光线,能够在光束不同部位的带宽中心波长区产生变化。这些问题可以通过在显微镜发射光部位安装产生校准间隙的适配器来补偿,因此,将滤光片转换轮附属配件和其他光学设备安装在平行光路中,就需要适配器起作用。

在一些多通道和光谱成像系统中能同时进行多色成像或者光谱分离和线性分离而不用转换滤光片,这些系统中采用单一的数码摄像头探测器。这些装置可以降低通常在滤光片转换轮转换过程中产生的假象,保持完美的成像。多通道系统在进行大量多色荧光实验中(比如共振能量转移)起着非常大的作用,在这种实验中,单一的像素配准出错就会引起很大的误差。这些不足会限制滤光片的性能和传感器有效成像范围,降低幅度从一半到四分之一(依赖于内部光束分离器和滤光片的性能)。新的多通道系统部分的抵消了将光分散到两个不同探测器产生的空间限制(数码摄像头),每一个探测器都装有独立的滤光途径和精细的焦距调整保证像素的配准。

   

    4中所示的是波长转换装置,图4(a)中是光通过干涉光束进入光路,图4(b)4(c)是直接将发射光导入不同的路径中。一个典型的滤光片转换轮的配置如图4(a)所示,它是由一个外部单元控制,在25-40ms时间内快速转换。转换轮的优势就是可以快速灵活的更换滤光片组合和激发光及发射光的不同配置。双通道成像系统的外部结构和内部剖面结构如图4(b)4(c)所示。多通道成像系统会在下面的部分详细阐述。

    多通道成像系统中,从显微镜出口出来的准直光通过单独的二色反射镜将入射光分成两个独立的光束。一个光束的波长在反射镜切割点之下,而另一个波长在切割点之上。这两束光通过光学系统折叠,可能会通过合适的滤光片调节光谱含量、强度等。光通过滤光片之后,光束通过普通的成像镜头在探测器面板上形成两个空间和光谱不同的图像。在把光源分成四路径的系统中,单独的二色反射镜要换成三带通的,工作原理基本一致。

    设计的变化使得多通道系统的输出可以分到两个摄像头系统中,这样能把不同探测器获取的图片整合为一个。在与狭缝系统和自动载物台结合使用时,多通道系统适合于光谱成像研究。多通道系统的一个主要特点是消除了图像获取延迟现象和由于滤光片转换轮转换过程中产生的震动问题。因此,任何延迟图像获取的问题最终都会影响探测器读出数据的速度(即图像输出)。在跟EMCCD耦合使用时,多通道成像系统能捕捉到亚细胞水平的反应过程。

    共聚焦和多光子显微镜中的活细胞成像受限于激光光源的光谱线。宽视场、碟片共聚焦、扫描视场显微镜以及白光TIRF显微镜中波长的选择最终可能会改变,至少在高端应用中会改善。光学显微镜的单色器结合含有波长选择板的弧光放电灯(一般是氙灯)和一个照明聚光系统共同起作用。

这些设备在由快速电流器控制的时候,能够精确地在毫秒级传递波长和带宽的改变。液晶可调谐滤光片可以应用于光谱成像、高分辨率、大孔径等的研究中。另一方面,液晶可调谐滤光片限制光谱范围,可变带宽,低光传输值,需要增加光学路径长度。声波可调谐滤光器在共聚焦显微镜中使用,但是还没有在其他成像模式中广泛应用。诸如色散、窄带宽、低分辨率、图像弥散和其他问题,在广泛应用于宽视场荧光显微镜的活细胞成像前要克服。

 

三、活细胞成像的照明光源

宽视场显微镜中常用的传统的照明系统是钨丝灯——卤素灯作为透射光光源,短弧气体弧光灯做荧光光源。在宽视场显微镜中极少用到激光,而共聚焦显微镜、多光子显微镜的广泛出现,增加了激光在光学显微镜中的应用。因为信噪比几乎是活细胞成像中最重要的变化参数,所以在活细胞的培养室需要高亮度的照明,来获得最大化的信号,达到最高的分辨率。但是,当用数值孔径1.4100 x物镜聚焦时,100w 汞灯将严重影响哺乳动物的活性,即使照射的时间只有几秒。用高强度的金属卤素灯或氙灯照明时,如果采集速度较慢,也出现同样的问题;如果用激光,即使速度比汞灯快,也同样会破坏细胞。 所以,要仔细的调节照射样品的光源,包括强度、波长。对于某些观察,只有一些光谱波段是有用的(如荧光团,光活化,光漂白等)。实际上,所有的应用中,在选择照明水平和波长限制等时,都需要在成像和维持细胞活性上做出折中。

光照强度对于观察来说是否太强,一个最好的标准,就是在这种实验条件下观察细胞是否能进行并完成有丝分裂。有些细胞,如胚胎,比较能承受可见光,可能是它们缺少响应DNA破坏的分裂周期。然而,大多数的哺乳动物细胞株,包括袋鼠、猪肾细胞、印第安赤鹿,都对光线极敏感。此外,会有滤色片安装在光路里,用于阻挡光源的紫外和红外辐射。

即使是现在荧光成像常用的带宽滤色片,对可见光波段有很高的阻挡,它们仍然能使极低的波段和高波段通过。因此,明智的方法是在光路中安装便宜的滤色片,来阻挡可见光终端的波长。添加附加的滤色片对于汞灯来说尤其重要,因为它们会释放非常高的紫外光。金属卤素灯会释放红外光,所以活细胞观察需要红外滤光片。而氙灯产生极少的紫外光,但在近红外有发射峰;越来越流行的金属卤素灯产生的谱线与汞灯相似,在长波段有高水平的发射。

   

细胞成像时,对于增强衬度的观察方法(主要是DIC、霍夫曼和相差),最普遍的光源是100w的金属卤素灯。在长时间实验中,这种灯非常稳定,在正常工作状态下,只观察显示的输出功率的变化即可。在做长时间的延时实验时,如采集几百幅甚至几千幅图像,要保证光照的稳定,调节功率的设备需要安装在系统内。通常,这种情况在线路功率频繁变化的实验室要用到。当使用绿或红光片阻挡紫外光,或加蓝光片增强细胞活性时,明场的整个图像光照强度会减少。大多数情况,546nm的绿光片常用于DIC和相差观察,更长波段的滤色片也常使用。经典的绿光片用于明场成像的像差校正,而在近代高端的萤石物镜和复消色差物镜中已经不再需要。

总体来说,明场成像的时候应该使用那些对样品伤害最小的波段的光源。广泛的调查发现绝大多数细胞对紫外光和红外光有极小的承受力,而对红光波段敏感性极低,其次是绿光和蓝光。因此,尽管长波段的光在分辨率上会稍差,一些CCD对此波段也不敏感,但从生物学的角度考虑的话,都应该用长波段的红光(600-650nm)观察活细胞。毕竟图像的解析率没有细胞的活性重要,而且分辨率受到众多因素的影响,如内部细胞的移动、温度变化、 光学和照明系统的不完善。CCD灵敏度的这些限制被厂家及时响应,他们会争取在整个可见光波段都产生均匀的感度。

短弧等离子灯比其他连续照明的光源有更高的亮度和辐射输出功率,非常接近理想的点光源。但是,弧光灯比白炽灯(金属卤素灯)显示出更强烈的波动,因为气体等离子本身就不稳定,而且受到磁场和电极的影响。金属卤素灯含有卤化物,如碘、溴,另外有水银,具有一个钨丝灯环,防止金属元素蒸发,并增加使用寿命和灯泡的稳定性。这些光源现在广泛应用于荧光显微镜中。

荧光显微镜的有效波段350-700nm,一个标准汞灯(HBO100w)只能达到45%的辐射输出功率。其主要的能量集中于以下的主要谱线366nm10.7%)、436nm(12.6%)546 nm (7.1 %)、和579nm (7.9 %)  氙灯常用于宽的激发谱线。氙灯的光谱输出模拟太阳光,因为它提供了宽的谱线,无论在紫外还是可见波段都没有明显的峰值。

 

四、活细胞成像的软件

    为光学显微镜设计的数码相机与主机计算机有相连的接口,能够通过软件调节相机的设置、预览样品、成像、储存数据。最常见的相机接口有火线(IEEE-1394)、通用接口(USB),传统的串行接口(RS-422)、小型计算机系统接口(SCSI),和宽光谱专利接口——由相机整合的一个微电路板插入计算机。活体成像用的相机要有快速的微处理器、大的存储器、以及大的硬盘空间用于存储图像和数据。推荐大于3兆的存储器,至少1GB内存。硬件相对便宜,所以工作站可以配250GB的硬盘,高性能的采集卡会更方便。推荐可以刻录的CDDVD。显示器最好是高分辨率的纯平显示器,占用桌面空间小,提供明亮、锐利、无闪烁图像。

    大多数数码相机用的图像获取软件用于相机设置,如增益、补偿、曝光时间、合并。更精细的软件还能够处理图像,如控制亮度、对比度、伽马值、添加伪彩、图像合成、叠加、做动画等。最高端的软件具有更广泛的功能,图像分析、反卷积、复杂的测量,并可以控制硬件(如滤色块转盘、光闸、Z轴调焦、载物台等),对于自动活细胞成像是必要的。要求来自相机和软件制造商的驱动都是可用的。另外,很多相机厂家提供软件开发包,为使用者提供特殊的用户化软件。现代的共聚焦显微镜所配的软件还具有多种功能,包括共定位、光漂泊、荧光共振能量转移、光活化等其他技术。为用户化的活细胞成像选择软件,研究者要考虑最具灵活性的软件包。

 

五、结论

为活细胞研究的光学成像系统配备载物台时,最重要的就是考考虑在保证细胞活性和在时间、空间分辨率二者之间做出适度的折中。大多数显微镜的设计都是为了获取最高质量的图像,而不是保证最好的细胞培养条件。然而,仔细筹划,一台标准的显微镜是可以被改造成真正的活细胞成像系统的。必要的筹划包括样品培养室、焦点漂移、数码相机、光源、光闸、滤色块、防震设备、以及用于控制全局的软件将所有部件整合到一起。在前面几节中讨论了系统的搭配有很多选择,在大量的调查中证明了它们的实用性。

 

来自显微镜 http://www.microimage.com.cn

此文为中国显微图像网原创专题系列文章,转载请注明,谢谢!

 

中国显微图像网推荐英文链接:

http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/automaticmicroscope.html

更多相关搜索: