细胞凋亡检测(Microimage译)

http://www.microimage.com.cnCatty(2009-06-29 09:52:38)

科技聚焦

近年来,对癌症和细胞学领域的研究更多集中在细胞死亡上。但是就在最近,像罗氏这样的公司对细胞凋亡相关研究很感兴趣。这样的研究已经超出了简单的细胞死亡的范畴外。无论来自大制药公司做新药开发的研究人员,还是科研机构研究阿尔茨海默症的人都在讨论细胞死亡的机制,什么路径受到影响,死亡的阶段何时被发现,甚至是怎样才能阻止死亡的发生。

目前细胞凋亡的研究的方法很多,研究人员可以分析单一或者群体细胞的凋亡,活体动物和福尔马林固定并石蜡切片样品等。他们用光学或者荧光显微镜,流式细胞仪或分光光度计来研究凋亡,还可以通过分析RNA和蛋白表达的参数,组氨酸修饰和质膜的磷脂定位及膜电位进行研究。

 

死亡或生存

起初,许多研究人员的兴趣主要在检测是否有一个特定的处理会杀死细胞或者阻止它们死亡。甚至对于他们来讲,是否所有的细胞都经历了程序性死亡或者一些经历简单的坏死都不重要。他们需要知道的是在仔细研究这条路径和调整敏感度测定之前是不是发生了什么反应:他们需要的答案是“是”或“不是”。所有活细胞或死细胞测定——如棉兰染色或PI染色(碘化丙啶)——都会筛选出已经凋亡的细胞和坏死的细胞。但是,还有一些正在凋亡过程中的细胞通过染色并不能区分出来。因此,染色研究凋亡过程需要与其他方法相结合。

细胞膜的结构重组在破裂之前(膜破裂会使PI聚酰亚胺进入膜内)。在很多的凋亡细胞内,膜的结构重组会导致磷脂酰丝氨酸(PS)暴露到细胞质膜的外膜中,这一过程可以用Annexin V染色观察到。有几家公司推出了双染色试剂盒,可以同时分析细胞膜的完整性并检测PS,帮助科研人员找出细胞是开始进入凋亡还是已经进入到凋亡最后的阶段。当然,还有一些类型的细胞可以在表面上持续的表达出PS,所以Annexin V染色可能会出现假阳性。细胞膜出现水泡状是早期细胞凋亡的重要标志,但是想要得到典型了泡状细胞非常困难,因为即使样本很少也需要很长时间。

其他的分析方法,如末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口标记(TUNEL)和琼脂糖凝胶电泳,利用了凋亡另一个标志来分析:细胞DNA被切割成大约200bp的片段。当这些方法用于分析凋亡的时候,一般检测到的都是凋亡晚期阶段的细胞,早期的凋亡细胞检测不到。

 

更深入

细胞程序性死亡可以由很多不同的路径诱导,每一个路径有另外一些途径引发反应。简单来说,凋亡在不同的阶段都可以被抑制(通常在癌症中)。研究最多的路径是下面这些内部和外部的途径:前者是由胁迫或者创伤引起,比如热激和DNA损伤,这二者可以导致细胞色素C的释放和线粒体其他因子的释放,随后会激活丝氨酸蛋白酶,最终会使细胞损伤得到控制。外部路径由更直接的半胱氨酸蛋白酶级联反应激活,是TNF-受体家族成员参与信号转导途径的最终反应。内部和外部传导途径最终在半胱氨酸蛋白酶3会合,这样是半胱氨酸蛋白酶3可能是最常见的细胞凋亡分析靶点。

一旦细胞凋亡被确定,研究人员可能会想更深入的研究它的发生机制。现在的研究趋势是找出为什么细胞参与到下面的特定途径中。每天,都有与凋亡相关的基因和蛋白被发现。已经有一些凋亡的抑制剂和诱导剂开发出来,有的是单独的生物活性试剂,有的是试剂盒的一部分。

还有很多检测死亡路径内部组分的手段也已经被开发出来了。在这些方法中最常用的是一些用于检测特定的半胱氨酸蛋白酶或一系列半胱氨酸蛋白酶。另外还有一些方法通常依赖于靶点切割底物产生的信号,或者抑制物与靶点结合或者靶点免疫反应检测等。由于半胱氨酸蛋白酶通常在半胱氨酸蛋白酶前体中持续表达,所以这些检测方法可以区分半胱氨酸蛋白酶前体和半胱氨酸蛋白酶的活性态。

除检测半胱氨酸蛋白酶之外,也可以检测许多其他路径上的成分来判定凋亡状态。一些制造商提供的试剂盒可以测定细胞色素C的释放和线粒体膜电位的变化。举例来讲,定量测定如FasLBcl-2的蛋白或者其他已知的能影响凋亡组氨酸磷酸化的蛋白。抗体(通常是抗体组)也可以检测已知的参与细胞凋亡过程中的组分,包括自然产生的诱导物和抑制物。

 

更宽

通常检测一个已定问题的其他补充方面需要非常谨慎——检测凋亡细胞中存在的半胱氨酸蛋白酶,和某些处理是否在半胱氨酸蛋白酶上游。

与此类似的是,有很多方法已经用于研究一个特定方面的问题,这些方法可能会用于对同一结果不同认证中。或者可能根据价格,设备,操作方便性,组织材料的准备或者历史条件等因素来选择合适的方法。最常用的方法一般有多种使用形式。举例来讲,TUNEL,可以用荧光或比色指示剂在荧光显微镜、普通光学显微镜或流式细胞仪上观察。试剂盒可以用于检测完整的、冷冻的、固定的和福尔马林固定后石蜡切片样品,有时还可以结合染色的总DNA观察。进入核小体中的DNA片段也可以通过ELISA或免疫杂交方法对细胞裂解液或上清液检测。

TUNEL常用于一些测定量较小的基础研究实验室中。这种方式比较浪费时间而且逐个细胞检查,但是并不需要特殊的仪器。另一方面,大的制药公司需要多功能、自动的高通量的测定方法比如ELISA和流式细胞仪。甚至有一些试剂盒也可以在体外对凋亡细胞染色。在很多有半胱氨酸蛋白酶的检测系统中,当抑制剂与有活性的半胱氨酸蛋白酶接触时,这些小分子有细胞透性的抑制剂和荧光基团被切割,使它们不能离开细胞。在FLIVOICT制造和销售)中,这个复合物可以注射到活体动物中,使得细胞凋亡过程可以实时观察或者在杀死活体动物后通过一些技术可以观察。

 

未来研究

对于细胞凋亡领域的检测和研究仍在进行。半胱氨酸蛋白酶ELISA方法在将来也可能很普及。但是从整个动物的成像观察到抑制剂和检测相结合的试剂盒中,再到实时定量PCR,这些方法将来都会给研究人员更多的选择。

 

 

国显推荐原文出处:    原文作者:Josh P. Roberts

 

http://www.biocompare.com/Articles/TechnologySpotlight/949/Apoptosis-Detection.html

 

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