冰冻切片HE染色步骤

http://www.microimage.com.cn(2008-12-25 18:00:15)

 

一、操作方法及步骤:

取材,未能固定的组织取材,不能太大太厚,厚者冰冻费时,大者难以切完整,最好为24×24×2mm

取出组织支承器,放平摆好组织,周边滴上包埋剂,速放于冷冻台上,冰冻。小组织的应先取一支承器,滴上包埋剂让其冷冻,形成一个小台后,再放上细小组织,滴上包埋剂。

将冷冻好的组织块,夹紧于切片机持承器上,启动粗进退键,转动旋钮,将组织修平。

调好欲切的厚度,根据不同的组织而定,原则上是细胞密集的薄切,纤维多细胞稀的可稍为厚切,一般在510um间。

 

二、冰冻切片时的注意事项:

防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净,需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方,如果有残余的包埋剂粘于刀或板上,将会破坏甚至撕裂切片,便切片不能完整切出。

多例多块组织同时需做冰冻切片时,可各自放于不同的支承器上,于冷冻台上冻起来,然后依据不同的编号,依序切片,这样做既不费时也不会乱。

放置组织冰冻前,应视组织的形状及走势来放置,所谓砍柴看柴势,切片也是如此,如果胡乱放置,就不能收到很好的效果。

组织块不须经各种固定液固定,尤其是含水的固定液,在未达到固定前,更不能使用。临床快速冰冻切片,不须要预先固定,一是为了争取时间,二是固定了的组织,反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片,就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前,其中的水份也可渗入到组织中去,当冰冻发生时,这些水份就存留于组织中,形成了冰晶。

当切片时,如果发现冰冻过度时,可将冰冻的组织连同支承器取出来,在室温停留片刻,再行切片,或者用口中哈气,或者用大拇指按压组织块,以此来软化组织,再行切片。另者,调高冰冻点。

用于附贴切片的载玻片,不能存放于冷冻处,于室温存放即可。因为当附贴切片时,从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差,当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时,由于两种物质间温度的差别,当它们碰撞在一起时,分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力,使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片,由于温度相同,没有发生上述的现象。

 

三、冰冻切片的快速染色方法:

 切片固定30秒-1分钟。

 水洗。

 染苏木素35分钟。

 分化。

 于碱水中返蓝20秒。

 伊红染色1020秒。

 脱水,透明,中性树胶封固。

冰冻组织12分钟,切片1分钟,固定1分钟,染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程,结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种,如甲醇循环的半导体冰冻切片法,二氧化碳冰冻切片法,半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等,这些方法在目前来说已很少使用,因此在这里不作阐述。

 

常规方法:

1)冰冻切片固定                     1030 s

2)稍水洗                            12 s

3)苏木精液染色(60              3060 s

4)流水洗去苏木精液                  510 s

51%盐酸乙醇                        13 s

6)稍水洗                            12 s

7)促蓝液返蓝                        510 s

8)流水冲洗                         1530 s

90.5%曙红液染色                   3060 s

10)蒸馏水稍洗                        12 s

1180%乙醇                          12 s

1295%乙醇                          12 s

13)无水乙醇                          12 s

14)石炭酸二甲苯                      23 s

15)二甲苯(                      23 s

16)二甲苯(                      23 s

17)中性树胶封固。

 

注:第(14)步如果不用石炭酸二甲苯,可改用无水乙醇,染色结果为:细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。

 

封片   切片染色后封片常用中性树胶,酸性的树胶可使胞核褪色,如树胶放置时间过长,因氧化而变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓,封片时容易导致气泡;过稀,封片时易使胶外溢,影响美观,也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。

 

在整个染色过程中不让切片干涸:切片完全干涸,会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓龟裂现象。也会使部分细胞核透明不良,看起来像黑色的细胞核,即形成黑核

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