一、ELISPOT 系统原理

ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay，其技术原理与ELISA相似。其实验设计是在培养盘底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。细胞经适当分离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素（Biotin）标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下染色斑点。ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点进行计数， 1 个斑点代表 1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）。

二、实验流程

三、ELISPOT系统组成特点

ELISPOT由显微镜光学系统，软件分析和CCD构成。显微镜是它的主要组件，它关系到系统的成像质量，通常有正置和体式两种形式。

四、ELISPOT的优势

ELISPOT 分析使单细胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感，因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡，或者被临近的细胞上的受体捕获，或降解之前。

最低至1：100万细胞精度的活体外频率测量。这种分辨率已经远远超过使用细胞内细胞因子的四聚物染色和 ELISA 法测量的精度。这种高敏感度是非常关键的，因为抗原特异性 T 细胞在体外都是典型性的低频率。

高产量 T 细胞分析成为可行。一个经过训练的相关实验室小组可以测试成百的样本中几十种抗原的反应。

只需要少量细胞，就可以用于通其他细胞学分析方法进行比较。例如，45毫升的血液就足以用于测试600种不同抗原/肽类物质的反应。

可以定义CD4和CD8细胞的免疫因子指标。这是因为只需要少数细胞，分析就可以在高产量模式下进行。ELISPOT 分析在筛选肽库，绘制免疫因子方面是一个理想的工具。

用于确定抗原特异性 T 细胞的功能性亲和力。这最大可能受到肽类药物刺激至50%的影响。

可以用于研究未经药物处理过的细胞的分泌过程。如果观察到净产量减少，可以确定这种区别是来自于分泌细胞的减少，还是每个细胞分泌产量的减少。

淋巴细胞在 ELISPOT 分析后依然存活。这使得分析之后进行增值，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能。