详解2014诺贝尔化学奖:超越光学显微成像极限

http://www.microimage.com.cn(2014-10-08 19:46:36)

 图一: 在19世纪末,恩斯特•阿贝(Ernst Abbe)对光学显微镜的分辨率限制做出了界定,认为大约是光波长的一半,即约为0.2微米。这意味着科学家们可以辨别完整细胞,以及其中一些被称为细胞器的组成部分。然而,他们却无法分辨一个正常大小的病毒或者单个蛋白质。
图2:在常规光学显微镜中,可以区分线粒体的轮廓,但其分辨率却无法超越0.2微米。图2:在常规光学显微镜中,可以区分线粒体的轮廓,但其分辨率却无法超越0.2微米。
图3:第一张由斯特凡•W•黑尔(Stefan W. Hell)使用STED显微镜拍摄而成的图像。左边为使用传统显微镜拍摄的大肠杆菌,右边是使用STED显微镜拍摄的同样的大肠杆菌。STED图像的分辨率是前者的3倍  图3:第一张由斯特凡•W•黑尔(Stefan W. Hell)使用STED显微镜拍摄而成的图像。左边为使用传统显微镜拍摄的大肠杆菌,右边是使用STED显微镜拍摄的同样的大肠杆菌。STED图像的分辨率是前者的3倍

  新浪科技讯 北京时间10月8日消息,2014年度诺贝尔化学奖授予两名美国科学家以及一名德国科学家,以表彰他们在“超高分辨率荧光显微技术方面的贡献”。来自美国 霍华德·休斯医学研究所的埃里克·本茨格(Eric Betzig),德国马克斯普朗克 生物物理化学研究所的史蒂芬·赫尔(Stefan W. Hell)以及美国斯坦福大学的威廉·默尔纳(William E. Moerner)共同分享了今年的化学奖。

  光学显微成像技术向纳米尺度的迈进

  血红细胞,细菌,酵母菌以及游动的精子。当17世纪的科学家们第一次在光学显微镜下看到这些活生生的生物现象时,一个崭新的世界在他们的眼前打开了。这就是光学显微成像技术的诞生。自那以后,光学显微镜已经成为生物学研究领域最重要的工具之一。其他显微成像技术,如电子显微镜,都需要进行样品的制备,而这样的制备过程会杀死细胞。

  借助分子发光技术超越物理极限

  然而,长期以来,光学显微成像技术的发展却一直受制于一个物理极限值的约束。1873年,显微技术专家Ernst Abbe提出了传统显微成像技术的物理极限值:这种技术的分辨率将永远不能超过0.2微米。这一预言导致在20世纪的绝大多数时间里,科学家们都相信光学显微成像技术将永远无法让他们突破到更细微的尺度上(Fig 1)。一些细胞内部的细胞器,如为细胞活动提供能量的线粒体,它们的轮廓是可以看到的。但要想进一步观察更小的对象,如细胞内部单个分子之间的相互作用则是根本不可能做到的。这就有点像是观察一座城市,你可以看到城市里林立的高楼,但却无法看清其中生活的居民们进进出出的日常生活。为了了解细胞的日常运作,科学家们需要对单个分子的活动进行追踪。

  然而Abbe提出的这一物理极限由于今年的诺贝尔化学奖获奖人的工作被突破了。从理论上说,现在再也没有任何障碍,阻止科学家们对更小尺度上的物体进行观察了。于是,显微成像变成了纳米显微成像。

  在突破Abbe极限的方案中,有两种各自独立发展出来的技术方法。而整个故事还得从1993年位于芬兰西南部的一间学生宿舍里讲起。有一天,当史蒂芬·赫尔在翻阅一本量子光学书时,他想到了一个绝妙的主意。

  直面Abbe极限的年轻挑战者

  1990年在海德堡大学获得博士学位之后,史蒂芬·赫尔一直在设想超越一个多世纪前提出的Abbe极限的方法。想要挑战一种现存的主流观点是令人兴奋的。但当时德国的几乎所有顶尖科学家都对他的想法持怀疑态度,于是赫尔转而向遥远的北方寻求支持。芬兰图尔库大学一名主攻荧光显微成像技术的教授给了他在自己研究组里的一个职位。赫尔坚信一定有着可以突破Abbe极限的方法。而当他在一本量子光学书中读到有关受激发射的内容时,一种全新的想法在他的脑海中逐渐成型。2009年时他曾经这样评价当时自己的感受:“当时,那个想法吸引了我。我终于有了明确的想要去追求的方向。”

  解决方案:纳米尺度的闪光样品扫描

  在芬兰图尔库大学,赫尔专攻所谓荧光显微成像学,这是一种技术方法,科学家们借助荧光分子对细胞的局部进行成像。比如说他们可以利用荧光抗体结合的方法来观察分子DNA。他们利用短暂的闪光激发该抗体,让它们在短时间内发光。如果抗体与DNA结合了,那么它就会从细胞的核心部位发光,因为那里正是细胞核内存储DNA的位置。通过这种方法,科学家们可以判断某一特定分子的所在位置。但这样也仅仅是能让科学家们确定大团分子,如缠绕纠缠的DNA分子的所在位置。这样做的分辨率太低,难以区分出特定的DNA链。你可以想象一下看到缠绕的纱线,而看不清单根纱线的场景。

  而当史蒂芬·赫尔读到有关受激发射的内容时,他意识到应当有可能制成一种装置,其使用纳米闪光灯扫过样品,每次一纳米。利用受激发射原理,科学家们可以冷却荧光分子。它们将一束激光束对准一个分子,后者立即失去能量并变得暗淡。在1994年,史蒂芬·赫尔发表了一篇文章陈述了自己的这一想法。在这一他设想中的技术方案,也就是所谓“受激发射减损技术”(STED)中计划采用闪光来激发所有的荧光分子,随后利用另外一次闪光让所有分子荧光熄灭——那些位于中部位置上纳米尺度空间内的除外(图 2)。当进行记录时则只记录下这一部分。让这一光束扫过整个样品表面,并连续记录光强信息,就有可能得到一张整体图像。每次允许发出荧光的空间区域越小,最后得到的图像分辨率便越高。于是,从原理上说,对于光学显微成像的极限再也不复存在了。

  在德国研制首台纳米闪光装置

  然而史蒂芬·赫尔的理论文章并没有立即在学术界引起关注,但却足以让史蒂芬·赫尔在德国马克斯普朗克生物物理化学研究所获得一个职位,在接下来的数年里,他将自己的设想逐渐变成现实:他开发出了STED显微镜。2000年,他证明了自己的技术方法在实际工作中是可行的。当时他对大肠杆菌进行了摄像,其分辨率是此前任何光学显微镜都从来未能达到过的(图 3)。

  STED显微镜通过多次小区域上采集光线并最终形成整体成像图。与之相反,此次获奖的第二种技术方案,即所谓“单分子显微成像技术”,则涉及多幅整体图像的叠加。埃里克·本茨格和威廉·默尔纳各自独立的奠定了这项技术的基础。这一技术的最初故事是从默尔纳首次成功探测到单个微小的荧光分子开始的。

  默尔纳——首次探测到单个荧光分子

  在大多数化学方法中,比如测量荧光的吸收,科学家们一般都是同时对数以百万计的分子同时进行观察。这类实验得到的结果一般代表的是典型或平均分子的情况。科学家们只能接受这样的结果,因为这是无法改变的。但长期以来他们都一直梦想着有朝一日能够对单一分子进行直接的测量,因为更加详尽和丰富的认识或许能够带来对一些现象,比如疾病发展过程更深刻的理解。

  于是,在1989年,当默尔纳成为世界上首位成功测量单个荧光分子光吸收的科学家时,那是一项伟大的成就。当时他在IBM位于加州的研发中心工作。这项实验开启了通往新的未来的大门,并启发大量化学家将他们的注意力转向单分子研究,其中一位便是埃里克·本茨格。

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