超高分辨率显微镜揭示细胞分裂过程的难解之谜(Microimage译)

http://www.microimage.com.cntina(2014-04-04 16:58:34)

(以下内容由中国显微图像网译制,转载请注明!)

 

瑞士科学家搭建了一个高通量3D超高分辨率显微镜,在整个细胞周期,对细菌骨架蛋白FtsZ以纳米分辨率成像。

蛋白是大多数细菌细胞分裂的要素,它们是抗体靶向下一代的关键因素。过去尝试在整个细胞周期中得到一张两张的纳米级图像,都不能解释细胞周期的整个故事。

细胞分裂周期,FtsZ蛋白在细胞周围形成一个条带,被称为Z环,在细胞分裂时起抑制作用。

超高分辨率荧光显微镜方法,包括2D光激活定位显微镜、3D PALM3D结构照明技术(SIM)在内,都能在这个过程中看懂Z环组织,但却不能揭示条带的结构以及细菌与蛋白之间的相互作用。

"Z环直径大概500nm,尺寸小,活体很难观察,"École polytechnique fédérale de Lausanne生物物理实验室的Seamus Holden教授解释说:"以前的测量不能解决这个问题,因为他们没有特定标记、活体成像、高的3D空间分辨率、样本尺寸太大或研究细胞周期蛋白的能力。"

有了以上想法,Holden及其同事开发新的软件和硬件,实现对上百个同步细菌的高通量PALM,自动化采集在同一细胞周期的几百个细胞的图像。

 

超高分辨率图像:C. crescentus细胞周期Z环的3D结构

"我们需要采集几百个视野下的PALM图像,时长几个小时," Holden说:"这显而易见需要自动化,所以我们搭建了高通量PALM."

据研究者说,一个关键性突破是开发出开发源运算-AutoLase-PALM下,这可以自动控制活性荧光基团的密度,让密度低到足以实现单分子定位。

"我们想出了一种运算方式,它能简便而稳定的评估活性荧光基团的密度秘诀是估计单个像素能亮多久,再设置一个阈值,如果时间足够长,密度就相当高了。"Holden说。

研究者以闭环模式使用运算控制光敏激光,实现活化荧光基团的密度在目标范围内。

"一旦我们能管理这个,自动PALM就变成可能," Holden说:"运算非常快,将来会扩展到大视野快速sCMOS的应用上。"

在自动PALM测量时,研究者也设法去除减少分辨率漂移的因素,如稳定显微镜等。

Holden说:"我们把物镜固定在架子上-铝架,不放在物镜转盘上,显微镜放在机柜里,与温度和气流隔绝。"

研究者还利用外部相差增加细菌明视野下的对比度,这样就能自动识别它们了。

"Nikon Ti显微镜自带相差方法,所以实际上我们已经适应了这些。"Holden补充说。

研究者说细菌模型的选择也非常关键。研究者选择了Caulobacter crescentus,它的细胞周期要几个小时,而E CoIi 的细胞周期仅仅20分钟。

Holden特别指出,C. crescentus的细胞周期越长,他和他的同事越有可能为不同细胞周期下几百个细胞的Z环成像。

"我们在PALM上位同步化细菌成像,所以在实验开始时,你成像的那些细菌都处于细胞周期的开始。那些后成像的细菌,处于细胞周期的最后阶段。" Holden说。

这些客服了光毒性, Holden补充说: "这个原则同样适用于真核系统。"

利用自动PALM技术,研究者确定了活体FtsZ细菌蛋白Z环的3D结构,检测了细胞分裂时环形态的改变。

研究者希望这些结果最终有助于药物开发者发现新的细菌细胞分离抗生素抑制因子。

"如果想用超高分辨率显微镜做细胞周期实验,我们的技术是很有用的,"Holden说:"在细胞中期组装对细胞分裂起作用的蛋白有很大一堆。现在我们也想去看看其他蛋白是怎么组织的。"

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