四款主流激光捕获显微切割平台选购之秘籍

http://www.microimage.com.cntina(2013-12-12 10:35:17)

摘要:

  LCM技术能够快速方便地从组织切片中分离和纯化单一类型的细胞群或单个细胞。无组织类型的限制,冷冻组织标本、石蜡包埋组织标本、细胞涂片、福尔马林或乙醛固定,以及HE染色或不染色的组织切片都能有效地进行捕获与转移,因此应用颇广。
众所周知,哺乳动物组织并非同源的。它是由不同的细胞类型组成,其功能、形态和基因表达皆不同。在很多时候,我们开展组织水平的研究,测定肝脏或肿瘤的基因表达,其实这样只能得到混合群体的平均数。通常我们会忽略个体差异,但最近发表在《Cell》杂志上的一篇文章为我们敲响了警钟。
怀特黑德生物医学研究所的研究人员发现,并非所有的细胞都有着相似的mRNA水平,包括侵袭性癌细胞在内的一些细胞生成的mRNA比其他细胞要多好几倍。如此看来,平均数已经不能满足我们的要求,单细胞分析才是正道。

1996年,美国国家癌症研究所(NCI)的Lance Liotta与他的同事在《Science》上发表文章,提出了一种称为激光捕获显微切割(LCM)的技术。他们写道,这种方法需要在组织切片上放置一个透明薄膜,在显微镜下观察组织,并通过持续时间短的红外激光脉冲选择性地让目的细胞附着在膜上。随后取下膜,直接放入DNA、RNA或酶缓冲液中即可。
次年,这项技术由一家名为Arcturus的公司商业化。两年前,Life Technologies收购了Arcturus,将其产品收入囊中。同时,市场上还有三家公司在开发类似的产品,他们分别是蔡司(Carl Zeiss Microscopy)、徕卡(Leica Microsystems)和MMI(Molecular Machines & Industries)。尽管平台各有不同,但大致原理是类似的。

原理
通过显微镜选择靶细胞,之后划出所需要的目的细胞。激光沿着所划的轨迹切割细胞。切割之后,开展下游分析。据介绍,大部分用户开展RNA的qPCR或芯片分析,也有一些开展新一代测序和转录组分析。

目前只有Arcturus的LCM仪器能使用红外激光来捕获细胞;而蔡司、徕卡和MMI都使用紫外激光对样品中感兴趣的细胞进行切割和收集。这两者有何不同,且听下文分解。
LCM技术能够快速方便地从组织切片中分离和纯化单一类型的细胞群或单个细胞。无组织类型的限制,冷冻组织标本、石蜡包埋组织标本、细胞涂片、福尔马林或乙醛固定,以及HE染色或不染色的组织切片都能有效地进行捕获与转移,因此应用颇广。

四大平台
Arcturus(Life Technologies)

Arcturus于1997年推出了世界上第一台商用激光捕获显微切割系统。目前的旗舰产品ArcturusXT也是唯一将激光捕获显微切割(LCM)和紫外(UV)激光切割融为一体的显微切割仪器。其他三家公司都使用紫外激光对样品中感兴趣的细胞进行切割和收集。
红外激光带来了温和的捕获技术,能保留生物分子的完整性,是单细胞和少量细胞的理想选择。紫外激光实现了前所未有的速度和精确度,非常适合高密度组织结构的切割和大量细胞的捕获。两种激光结合起来,让您能够轻松地收集同一样本中的单细胞和大块结构。

ArcturusXT的基本原理是通过低能红外激光脉冲激活热塑膜——乙烯乙酸乙烯酯(EVA)膜,在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上。将带有热塑膜的塑料帽,放到组织切片上的目标部位。显微镜直视下选择目标细胞,发射激光脉冲,瞬间升温使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上微小的组织间隙中,并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力,从而可以选择性地转移目的细胞。
ArcturusXT激光捕获显微切割系统有着开放的平台,能够升级并扩展,以满足不断变化的研究需求。可用的显微镜接口让用户能修改系统,开展其他的应用,比如增加一台照相机用于高分辨率成像。开放的系统设计还实现了载物台插板的轻松互换,以容纳不同的样本形式,如神经生物学研究所用的更大玻片。

徕卡提供LMD6500和LMD7000激光显微切割系统,利用紫外激光分离显微镜头之下的目标区域,并通过重力这种温和的方法来收集样品。
为了获得纯净的样品,精度对于显微切割是不可忽视的。在徕卡LMD6500和LMD7000系统中,使用高精度的光学组件来控制激光束移动。光束焦点有自动修正功能,分别有两种模式可供选择:全自动模式和交互模式,同时显微镜样品台和样品本身保持不动。通过这种专利方法,可以达到超乎想象的精度。

有时,快速收集样本对于下游分析来说也很重要。在显微切割过程中,只要移动轻巧的光学镜头就能控制激光束。这种方法可以在高倍率镜头下进行精确地切割,在低倍率镜头下进行快速切割,确保最快捕获目标样本,最大程度降低了组织降解的风险。
当目标区域被切割后,就会轻轻地掉落到收集管中,没有其他多余的复杂步骤。而且更重要的是,样品本身没有接触到任何其他物体,这就使污染的风险降至最低。收集装置可以预先加入培养液(针对活细胞)或缓冲液(针对下游分析)。

LMD6500和LMD7000这两款仪器的区别在于脉冲能量不同。LMD6500提供一个脉冲能量为50 μJ,固定重复频率的激光器,而LMD7000提供高达120 μJ的脉冲能量,且功率和频率可调。用户可以根据材料来调节激光的粗细、强弱和速度。

目前市场上主要有四家公司提供激光显微切割的平台,他们分别是Arcturus/Life Technologies、徕卡、蔡司和MMI。在上一篇文章中,我们介绍了前两个,这回则带您看看MMI和蔡司的产品,以及新手该如何选择。

MMI
瑞士MMI公司的单细胞获取平台有两大旗舰产品:CellEctor Plus单细胞分选系统和CellCut Plus激光显微切割系统。

• CellEctor Plus可从血液、骨髓、制备的组织细胞悬浮等液态体系中挑选出感兴趣的单细胞;
• CellCut Plus可从组织切片、贴壁培养细胞中将感兴趣的单细胞切割并收集下来。

CellCut Plus利用固态紫外激光对组织切片等样本中感兴趣的细胞进行切割和收集,“三明治”式的样本制备方式避免环境尤其是RNase污染。在整个分离过程中,激光都不与需要分离的样本接触,对样本损伤小,从而保证了样本RNA的完整性。
此系统在样本收集时采用PTP(Predefined Target Positioning)技术,将黏性管盖划分成若干区域,对组织切片中同种类型细胞进行黏附收集,提高样品的收集效率,节省成本;通过计量统计可保证下游的核酸、蛋白实验有足够的样本量。CellEctor Plus和CellCut Plus均是基于显微镜的产品,两大系统可完全整合在一起形成MMI单细胞获取自动化工作站,以“所见即所得”的方式,几乎涵盖所有的单细胞获取途径。
蔡司
蔡司的PALM MicroBeam也是利用聚焦激光束来切割和分离样本,不过它收集样本的方式比较特别。通过一种激光诱导的压力波将细胞弹入管中。MicroBeam的弹射力就好像在您的样品下方发生光诱导的微型爆炸,随之而来的冲击波向上推动组织。对于较大的区域,MicroBeam也可以使用粘性管盖。这对蛋白质组研究特别有用,因为您可能需要较大的样品来获得足够的信号。
专家的选择和建议
你们若打算采购一台LCM仪器,一定会被繁复的仪器参数和众多专业术语绕晕。撇开这些不谈,我们先看看专家会选择何种仪器,开展哪些应用。

LCM技术的发明人Lance Liotta如今是乔治梅森大学(George Mason University)应用蛋白质组学和分子医学中心的联合主管。他们实验室拥有三台LCM系统,都是来自Arcturus:第一代手动的PixCell仪器;具有图形用户界面的Veritas系统;以及最新的双激光ArcturusXT™。
据Liotta介绍,实验室主要在临床试验工作中使用这些仪器。举个例子,该中心临床蛋白质组实验室的主管Virginia Espina在抗癌药物治疗前后,对100名乳腺癌患者的肿瘤组织进行显微切割。之后从那些样品中提取蛋白,上样到蛋白芯片上,以确定药物对近60个蛋白标志物的量和磷酸化的影响。此信息有望指导治疗决策。

Espina建议用户在准备开展激光捕获工作之前,考虑四个关键问题。第一,组织如何固定?是福尔马林包被石蜡包埋(FFPE)还是冷冻?它是新鲜的还是存档的?第二,你希望用它做什么?DNA相对容易收集,而RNA迅速降解。第三,你需要多少细胞?核酸可以扩增,因此可研究相对少量的细胞甚至单细胞。蛋白则需要更多材料。通常来说,大约在10000至50000个细胞。第四,你将使用哪种提取方法,它是否与下游实验兼容?
在美国SAIC-Frederick公司的组织技术实验室,研究助理Yelena Golubeva使用两种系统开展LCM工作:一台Arcturus的PixCell IIe和一台MMI的CellCut Plus。前者是用于切割相对小的区域,从单细胞到直径在25微米左右的区域。对于大的区域,她使用MMI,因为激光切割更快。Golubeva认为,就LCM而言,每个样品都是独特的。例如,小鼠肝脏样品的RNA相对稳定,而前列腺样品几乎马上开始降解。这是个经验问题。
Golubeva建议用户开展一些预实验。从一些感兴趣组织的切片开始。检验一下你希望使用的染料,看看它是否会损害你想要研究的生物分子。染色一块切片,从上面刮下一些细胞,提取出RNA,并与未染色切片的结果进行比较,了解整体质量和qPCR数据。如果OK,那么可以使用这种染料。

接下来,优化时间。在RNA质量下降之前,你能够在切割上花多少时间?十分钟?二十分钟?Golubeva认为,使用什么样的仪器都不要紧,你需要知道组织在LCM仪器以及你使用的耗材中表现如何。
专家也建议我们了解其他一些变量,比如切割的速度和力量,就像我们之前提到的徕卡LMD7000和LMD6500。7000的功率和频率可调,也能切割更硬的切片,比如骨头、牙齿以及植物纤维组织。

一般来说,冷冻切片最好在当天进行显微切割,切好的冷冻切片可暂时存放在-70℃低温冰箱备用。冷冻切片厚度约为10 μm,较厚的切片容易捕获到较多的细胞,但有可能导致非特异性地捕获邻近的细胞,较薄的切片捕获细胞量相对较少,但捕获的细胞比较纯净。
关于LCM,目前已经有3000多篇文献发表,新应用和新方法也在不断涌现。但如果你是新手,那么不妨读一读Lance Liotta实验室2006年发表在《Nature Protocols》上的操作方案1。

更多相关搜索: