常见扫描电子显微镜图像的缺陷和解决方法(图)

http://www.microimage.com.cn(2010-07-26 18:11:08)

  扫描电子显微镜最基本的成像功能是二次电子成像。它主要反映样品表面的立体形貌。由于样品的高低参差、凹凸不平,电子束照射到样品上,不同点的作用角不同,因此造成激发的二次电子数不同;再由于入射方向的不同,二次电子向空间散射的角度和方向也不同,因此在样品凸出部分和面向检测器方向的二次电子就多些,而样品凹处和背向检测器方向的二次电子就少一些;总之,样品的高低、形状、位置、方向等这些与表面形貌密切相关的性质,变成了不同强度的二次电子信息。电子束逐点扫描产生不同数量的二次电子,依次在荧光屏上显示出亮暗不同的点,也就是相应的像素。再由这些象素组成了完整的二次电子图像。

  1、荷电效应

  当入射电子作用于样品时,从样品上会发出二次电子,其发射率会随入射电子的加速电压而变化。图1是表示二次电子发射率随入射电子的加速电压变化的曲线,图中横轴V0 表示入射电子的加速电压,纵轴σ表示二次电子发射数与入射电子数之比,即σ=二次电子发射数/入射电子数。

图1 二次电子发射随加速电压变化曲线

  从图1 中可见,只有在V0=V01和V0 = V02时,σ等于1 ,即入射电子数与二次发射电子数相等,此时样品既不增加电子也没有失掉电子,样品不带电。除此两点外,样品会因吸收或失掉电子而带电。如果样品不导电(生物样品一般不导电),此时样品会因吸收电子而带负电,就会产生一个静电场干扰入射电子束和二次电子发射,这些会对图像产生严重影响,此称荷电效应。它会对图像产生一系列的影响:

  ①异常反差。 由于荷电效应,二次电子发射受到不规则影响,造成图像一部分异常亮,另一部分变暗。

  ②图像畸形。 由于静电场作用使电子束被不规则地偏转,结果造成图像畸变或出现阶段差。

  ③图像漂移。 由于静电场作用使电子束不规则偏移引起图像的漂移。

  ④亮点与亮线。 带电样品常常发生不规则放电,结果图像中出现不规则的亮点和亮线。

  通过长期、大量的实验,我们发现减少荷电效应的方法:

  ①导电法。 用金属镀膜、导电染色等方法使样品本身导电,使吸收电子通过样品台流向“地”,从而消除荷电效应。生物样品几乎都采用这种方法,但不是能完全消除。

  ②降低电压法。 把加速电压降低,使V0 = V02,λ= 1 ,入射电子数与二次电子发射数相等,就不产生电荷积累,消除荷电效应。通常使用加速电压为1~5 kV。但因此会使分辨率下降。

  ③快速观测法。 以尽快的速度观测和拍摄,使荷电效应影响不大时结束。一旦出现较明显的荷电效应只能改变观察区域或更换样品。另外,应尽可能使用低倍观察。因为倍数越大,扫描范围越小,荷电越迅速,影响越大。图2a所示为一生物样品由于荷电效应所产生的图像畸形与亮线,可以很明显的看出图像中、下部分发生明显移位畸形并散在分布数条亮线;图2b所示为在经过金属镀膜、加速电压由15kV降为10kV后同一观察部位图像。图像畸形与亮线已全部消除。

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  2、损伤

  扫描电子显微镜观测时,样品可能受到的损伤有:

  (1) 真空损伤。 生物样品从大气中放入真空中时,就会产生真空损伤,主要是由于样品干燥引起的。

  (2) 电子束损伤。 电子束的能量引起照射点的局部加热、化学结合的破坏等,造成样品的破裂或局部漂移。

  减少损伤常用方法有:

  (1) 临界点干燥法。 此法能快速干燥样品,减少样品收缩变形。

  (2) 降低加速电压及较小电子束流。

  (3) 加厚喷镀金属膜。

  图3所示为沙虫卵细胞膜在加速电压为15kV,电流在110mA 时,由于电子束的能量引起照射点的局部加热导致细胞膜表面膨胀破坏,可见图像中部一巨大隆起;图4则为将加速电压由15kV降为10kV,电流降为60mA,减少同一部位观测时间后,卵细胞膜真实的表面形态。

  3、边缘效应

  样品表面凹凸变化大的边缘区域,二次电子散射区域与样品表面接近的面积增大,结果使边缘区域二次电子发射异常地增加。在图像中这些区域特别亮,造成不自然地反差,称为“边缘效应”。这虽然并非由于操作引起地图像缺陷,但可通过适当地操作尽量减少。主要方法是降低加速电压,这可以使边缘效应相对减轻。图5所示为纳米复合材料冲击断口的图像,可见由于断口表面高低不平,边缘区域由于二次电子发射异常增加导致样品边缘异常增亮,无法显示出样品细节;图6为将加速电压由15kV降低为5kV后的图像,边缘效应明显减轻,但未能完全消除。

  4、结束语

  荷电效应、损伤、边缘效应为扫描电子显微镜图像常见的图像缺陷,这些缺陷一些是人为因素产生,一些则是由于扫描电子显微镜成像原理而不可避免产生,但我们都能通过一定的方法,如导电法、降低电压法、快速观测法等等而消除或减少图像缺陷的产生。在实际操作中,对于不同的图像缺陷,要灵活采用各种不同的方法,反复实验,并总结、分析各种方法的优劣,才能拍摄出更好、更真实的图片。

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