Andor 王德沛谈EMCCD在超高分辨率显微术中的作用

http://www.microimage.com.cnNancy(2010-04-02 10:22:54)

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人物简介:王德沛,英国安道尔科技有限公司(Andor)北京代表处首席代表。曾就读于北京大学无线电电子学系,1987年获得硕士学位。自1990年起进入光电子行业,对弱光探测领域的应用和市场有近20年的经验。自2006年北京代表处成立,一直负责中国大陆地区的销售渠道管理及市场开拓。

 

SRM技术背景:光衍射造成的分辨率极限成为显微成像分析和深入观察活细胞结构的主要障碍。目前最好的光学设备只能显示大小在200nm左右的结构,比这再小的物体难以直接观察。然而,有关细胞间通讯、生长、环境信号应答这些重要生理过程的细胞器官通常都小于200nm,如突触囊泡、受体蛋白复合物和细胞骨架组装物都小至50nm。只有借助直接观察和记录的光学方法,我们对它们功能的理解才能大大提高。

为解决以上问题,研究者开发出几种创新技术突破了Abbe极限,开辟了纳米尺度研究的新纪元。PALMIRASTORMFIONA以及其他相关方法已经开始产生显著的成果。这些创新的方法包括线性和非线性荧光模式,以及进一步发展了的现有点扩散函数分析方法。后来,一条基于荧光标记分子转换的研究线路引领了纳米显微技术的发展。根据每种技术特定的要求,使分辨率提高了2-100倍。超高分辨率显微术(SRM)的使用将会大大拓宽我们对生命过程机理的理解。最终,我们将能原位的揭示细胞的分子机理。

EMCCD在单分子探测和超高分辨成像方面的优势:电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)已经被成功的应用到多种富有挑战性的科学研究中,它的使用显著促进了弱光、高速成像技术的发展。由于这种信号采集过程具有典型的低信噪比特点,光子缺乏和对高速度的需求成为极大的挑战。EMCCD技术的主要优势是能在任何读出速度下从根本上克服相机的读出噪音。这使得EMCCD成功的应用到慢扫CCDICCD不能满足对灵敏度和曝光时间要求的领域。由于在高帧频、低光条件下极难获得高信噪比,这就奠定了具有最高灵敏度性能EMCCD的卓越地位,否则超分辨率技术的优势可能无法充分体现。

这里我们阐述在几种新技术中,EMCCD的高速度和高灵敏度是如何发挥作用的。这些新技术使我们能够更深入的观察那些原先只能用电子显微镜才能看到的显微结构。EMCCD的使用为解决重大生物问题打开了全新纪元,并改变了我们对活样品结构功能关系的看法。

Andor公司简介:安道尔科技有限公司成立于1989年,在科学成像、光谱学解决方案方面处于世界领先地位,公司开发和生产了一系列高性能数字相机。在过去的20年,Andor公司的创新使全世界的科学家得以检测低至单光子水平的光信号,捕捉十亿分之一秒内发生的事件。

 

 

Q1. 使用Andor哪些型号的EMCCD可以搭建SRM,这些EMCCD的特点和优势?

A1.  Andor iXon+系列EMCCD曾用于几种超分辨率显微术。采用512x512像素芯片的背照式DU897 EMCCD是到目前为止iXon系列中最常用于此应用的型号。Andor通过特别的设计获得背照式EMCCD的最佳效果,打造出专门的、真正高端的超高灵敏度科学级相机平台。iXon系列相机采用了深度TE致冷、真实增益、基线钳制和增益校准技术,所有这些对于SRMSuper Resolution Microscopy实验中图像的定量都是至关重要的。

 

 

Q2. Andor公司在超高分辨率上所做的工作有哪些?

A2. 2001iXon系列相机问世以来,Andor高端EMCCD就出现在单分子探测(SMD)领域中,并一直处于领先地位。我们一直和单分子探测领域的卓越研究者密切合作,Andor EMCCD也成为超高分辨率研究中相机系统的首选。Stefan HellAlexander EgnerW.E. MoernerXiaowei ZhuangTao Xu Paul SelvinHarald HessEric Betzig John Sedat等科学家的实验室都利用Andor iXon EMCCD突破了分辨率极限,因而进入全新的、令人神往的研究层面。

 

Q3. SRM的技术前景如何?是否会像共聚焦那样普及?

A3. 最近1-2年来,超高分辨率显微术快速发展,相关研究活动急剧增长,使得这项技术达到从世纪之交以来前所未有的高度。对于为突破衍射极限而奋斗的研究人员来说,超越200nm限制的观察能力是很迫切的想法。我认为,SRM技术的广泛应用将带来光学显微术划时代的转变,并且这些新方法一定能弥补传统共聚焦显微术的不足。鉴于SRM研究和文献呈指数增长,在不远的将来,不排除共聚焦型SRM超越宽视野和传统共聚焦技术,成为主要的显微工具。另外,还有其他重要因素,高端EMCCD的质量和相对较低的设备成本,也是SRM获得广泛普及的原因。

 

Q4. SRM已有的国内用户?能否谈谈系统的实际情况及使用效果?

A4. Andor很荣幸能和中科院生物物理所生物大分子国家重点实验室等国内一流的研究者一起工作。徐涛教授和陈良怡博士的研究组已经用Andor iXon EMCCD采集的结果发表了相关文章。另外还包括中国农大兽医学院的韩波教授和上海光学精密仪器所徐志章教授领导的研究组。

Q5. SRM的分类?像4PiSTEDPALMSTORMSSIM等,您比较看好哪些?

A5. 这个话题可以单独写一篇文章啦。简要的说,4PiSWFM等线性技术以及包括STEDSSIM在内的非线性技术目前在样品和所用探针上存在着一些技术挑战。尽管能展示出优异的图像,但使用的难易程度和有时过高的成本都会阻碍它们的普及。另一方面,包括FIONAPAINT在内的定位技术在具备高性价比的同时也需要相当严格的实验条件,这样可能在某些实验条件下会很难建立。最后,基于荧光分子转换和定位的STORM/PALM及其衍生的技术是容易使用的、能负担得起的,有可能在生物医学中被成功的广泛使用。 

 

Q6. 国内现有SRM的配置组成?价格?与传统显微镜或者共聚焦的主要差别是什么?

A6. 和共聚焦/宽视野显微镜最根本的差别,在于利用SRM技术,采集的图像不受衍射限制,即能看到20-80nm的图像细节,而在共聚焦/宽视野显微镜下是200-600nm

配置:至于系统配置,我们可以为PALM系统提供Andor 激光耦合器ALC Andor iQ iXon 897 EMCCD,用于突触功能和结构研究等各种应用。ALC可配405nm的激光(用于活化),高功率488nm561nm的激光用于激发和读出单分子信号。高达200mW488nm561nm激光确保快速读出,这样可以快速漂白,可以逐帧观察新分子。在PALMPALMIRAF-PALM实验中,利用Andor iQ能在采集过程中手动控制405nm激光,以调整被活化的分子数量。

对于所有的SRM系统,XY载物台的稳定性是很重要的,新近开发的压电陶瓷载物台满足了稳定性和移动精度的要求。Andor使用Mad Coty LabsPhysik Instrumente公司的载物台,这些可以被Andor iQ控制。

价格:包括405nm488nm/200mW561nm/200mW激光的ALCiQ和工作站,以及iXon+ 897 EMCCD在内的组件,大约需要花费十几万美元。

 

Q7. 搭建SRM时,需要注意哪些问题?

A7. 目前,一些公司包括ZeissNikon已开始提供配有Andor iXon EMCCDSRM系统,所以实验室可以获得一套即用设备了。另一个选择是自己搭建系统,通过整合激光、iXon+ EMCCD、带XY载物台的显微镜、滤光片、其他光学组件以及图像采集和分析软件。前面提到的用户都完成了这些工作,要自己搭建,这意味着用户需要自己定制、测试和完善他们的系统,以达到特定实验所需的最佳效果。

 

Q8. 目前有些厂家已经制造出商用SRMZeissPALMNikonN-SIM),Andor未来是否有这方面的打算?

A8. 目前,Andor可为用户提供我们的系统元件以构建用户定制的SRM系统。详见问题6

 

致谢:非常感谢Andor公司的周旻先生,他参与了全文的编译和校对。

 

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